禽多杀性巴氏杆菌Cp39粘附蛋白和荚膜的关系及其受体研究

研究内容：①利用基因敲除技术分别构建血清型A:1禽巴氏杆菌C48-3强毒株的cp39基因突变株和hexAB基因无荚膜突变株，并通过免疫电镜、流式细胞术及毒力试验验证Cp39粘附蛋白和荚膜的关系；②利用固相粘附试验和配体亲和印迹试验确定鸡粘膜细胞表面Cp39粘附蛋白的受体及其在不同宿主细胞中的分布，用MALDI-TOF-MS技术和Edman降解法鉴定Cp39粘附蛋白受体的特性。. 研究意义：①验证Cp39粘附蛋白与荚膜的关系，阐明关于Cp39粘附蛋白在细菌细胞中的位置及其与荚膜在致病性中的关系；②鉴定鸡粘膜细胞表面Cp39粘附蛋白受体及其在不同宿主粘膜细胞中的分布，为进一步研究Cp39粘附蛋白在受体上的结合域和抗细菌粘附提供了预防和治疗的线索。

禽霍乱是主要由血清型A巴氏杆菌引起的家禽和野生鸟类的一种接触性传染病，对养禽业造成了严重的经济损失。因此，研究禽巴氏杆菌菌体表面蛋白的免疫功能及其致病机理，为禽霍乱的防制提供新的线索。课题组根据禽巴氏杆菌C48-3株cp39基因和ompH基因序列的同源性以及国内外同行专家的建议，将本项目研究的目的基因cp39修改为ompH基因。本项目以C48-3为对象，采用同源重组的方法分别构建了hexABC基因和ompH基因的缺失突变株，通过生物学功能实验比较了野生株C48-3、突变株 C48-3△hexABC和突变株C48-3△ompH在荚膜结构、粘附能力、抗吞噬能力和致病性等方面的差异，确定了OmpH和荚膜在禽巴氏杆菌致病过程中的作用。采用配体印迹试验检测了CEF细胞和鸡粘膜细胞表面的OmpH受体，通过MALDI-TOF质谱鉴定了CEF细胞表面的OmpH受体，用OmpH和其抗体经配体印迹试验比较了OmpH受体在不同宿主粘膜细胞表面的分布差异。主要研究结果如下：. （1）电镜观察结果证实与野生株C48-3相比突变株C48-3△ompH和突变株C48-3△hexABC的荚膜合成能力明显降低；（2）蛋白印迹和RT-PCR结果表明hexABC基因的突变不影响ompH基因的表达，但ompH基因的突变抑制了细菌的荚膜合成能力；（3）小鼠毒力实验结果表明突变株C48-3△hexABC的毒力基本丧失，而突变株C48-3△ompH的毒力相对减弱；（4）粘附实验结果验证禽巴氏杆菌的粘附因子是OmpH而不是荚膜；（5）吞噬实验结果表明OmpH是具有抗吞噬的作用；（6）配体印迹试验结果表明CEF细胞表面的49kDa蛋白是OmpH的受体；（7）MALDI-TOF质谱结果表明OmpH受体是CEF细胞表面的ATP合成酶β亚基；（8）配体印迹试验结果暗示了OmpH受体在不同宿主粘膜细胞表面的分布差异可能与禽巴氏杆菌的宿主特异性相关。.