植物黄酮异戊烯基转移酶基因工程菌构建及其生物催化应用

Since the prenylation of flavonoids can not only diversify the structures of flavonoids, but also often enhance the bioactivities, bio-availabilities and drug properties, thus it is of importance in the course of the R & D of natural drugs. However, the supply of prenylflavonoids is very limited because of the rare occurrence in nature and the difficulty in chemical synthesis (poor selectivity, rigorous reaction condition, etc). In our previous investigation, it was found that the cultured cells and microsomes of Morus alba and Cudrania tricuspidata could selectively introduce prenyl group at C-6 position of genistein (sophoricoside and diosmetin) and C-8 position of chrysin. And, two novel prenyltransferases (PTases) genes have been obtained from the cultured cells of the two plants by RT-PCR, respectively. Based on these interesting and promising results obtained, the proposal is to obtain more PTase genes and construct recombinant strains with these PTases genes and their mutagenesis through homology modeling technique, for the purpose of clarifying the structures of the substrate-binding sites and broadening the substrate-spectrum of the PTases. This study will not only pave a way to disclose the structure-activity relationships between the PTases and flavonoids, but also exploit a novel and potent biosynthetic approach to produce a wide variety of structurally-diversified prenylflavonoids for the discovery of drug leads/candidates. .This project is established in self-dependent innovation, and is of importance in theory and practice.

黄酮的异戊烯基化不仅丰富了黄酮类化合物的结构多样性，而且常常能增加其生物活性及生物利用度，提高其成药性，在天然药物研究中具重要意义。天然界中异戊烯基黄酮分布有限，化学合成存在选择性差等问题，来源难以得到保证。在前期研究中，我们发现桑及柘树培养细胞及其微粒体能选择性地分别对外源染料木素（槐角苷及香叶木素）和白杨素的C-6和C-8位引入异戊烯基，并通过RT-PCR从培养细胞中成功克隆获得了2个新的异戊烯基转移酶基因。在此基础上，本项研究拟获得更多的异戊烯基转移酶基因并构建工程菌，在蛋白三维结构同源模建的指导下深入研究植物黄酮异戊烯基转移酶的活性结构域，并针对活性位点进行定点突变构造突变工程菌，拓宽其底物谱；旨在探讨异戊烯基转移酶的活性结构域、功能与底物结构之间的关系，为制备结构多样的活性异戊烯基黄酮类化合物及发现药物先导物/候选物提供新方法。.本课题立足于自主创新，具理论及实际应用意义。

黄酮的异戊烯基化不仅丰富了黄酮类化合物的结构多样性，且常常能增加其生物活性及生物利用度，提高成药性，在天然药物研究中具有重要意义。植物黄酮异戊烯基转移酶为植物次生代谢生成异戊烯基黄酮的关键酶，然而，目前已被阐明功能的植物异戊烯基转移酶基因寥寥无几，其研究具有较强的挑战性。克隆植物黄酮异戊烯基转移酶基因，构建工程菌进行异源表达，通过生物酶法催化合成结构多样的异戊烯基黄酮类化合物，不仅为黄酮异戊烯基转移酶的结构及功能研究提供科学依据，亦为制备结构多样的活性异戊烯基黄酮类化合物提供新方法，具有重大的理论意义与潜在应用价值。本研究从豆科植物苦参、乌拉尔甘草以及桑科植物桑和柘树中克隆获得了14个黄酮类异戊烯基转移酶基因并进行了功能鉴定。从苦参中克隆了新颖的黄酮异戊烯基转移酶基因SfFPT，发现SfFPT具有宽泛的底物选择性与很强的催化活性，既能催化不同类型的黄酮类化合物(二氢黄酮、二氢黄酮醇、黄酮及查尔酮)，又能接受DMAPP、GPP等不同链长的异戊烯基供体，还具有明显的位置(C-8)与立体选择性(2S)。从乌拉尔甘草中获得两个高度选择性的异戊烯基转移酶，其中GuA6PT为首个选择性催化5,7-二羟基黄酮C-6位的异戊烯基转移酶；GuPT1可以催化二氢黄酮类化合物的生物合成前体异甘草素的异戊烯基化，进而被查尔酮异构酶(GuCHI)催化生成异戊烯基甘草素，改变了异戊烯基化反应是植物异戊烯基黄酮生物合成途径最后步骤的传统认识。从桑和柘树培养细胞中克隆获得11条异戊烯基转移酶基因，其中MaIDT和CtIDT是首次发现的非豆科植物黄酮类异戊烯基转移酶，系统进化分析表明，它们与已报道的豆科植物黄酮类异戊烯基转移酶处于不同的系统进化分支，显示了植物黄酮类异戊烯基转移酶进化的多样性，这为从其他科属植物中寻找更多进化地位不同的黄酮类异戊烯基转移酶提供了重要启示。上述异戊烯基转移酶均具有高的催化活性及宽泛的底物选择性，可用于活性异戊烯基黄酮类化合物的立体及位置选择性合成。