温度敏感的TRPV2离子通道钙离子分电流(Pf)的测定研究

Transient receptor potential (TRP) channels是一个非选择性阳离子通道家族，它们是人和动物的分子感觉器，分别感受温度、痛觉、机械、味觉等基本环境因子和伤害性刺激。当TRP被激活时， 钙离子便流入TRP离子通道，并通过钙离子依赖性（激酶，分泌，收缩）产生细胞功能。因此TRP钙离子通透性是一个重要问题。本项目研究的重点是使用周专-Neher发明的测量阳离子通道"钙离子分电流"的方法(Pf，例如NMDAR通道Pf=10%)，研究TRPV1特性并测定迄今未知的温度敏感TRPV2离子通道的Pf，从而为研究它们的生理功能研究提供重要基础。申请人曾参与周专实验室测定HCN通道的Pf, 并掌握了Pf方法（Yu et al, PNAS，2004；Am J Physiol, 2007）。我们的预实验结果已经初步检测了TRPV1的钙离子Pf=5.4%。

瞬时受体电位（TRP）通道是一类多觉性，非选择性阳离子通道，通透Ca2+进入细胞。经此类通道的Ca2+内流在生理过程中起着重要的作用，例如Ca2+稳态调控和递质释放调控。外源系统中，TRPV2通道是一种主要对伤害性高温（>52℃）响应的一种通道，但是它在在体情况下的生理特性仍然不是很清楚。在本工作中，我们研究了TRPV2重要特性中的一种，Ca2+通透性，通过测量Ca2+分电流的方法（Pf-TRPV2=21.5%， Pf的测定联合了膜片钳法和fura-2荧光测定法）。和TRPV1对比，在他们的高度Ca2+选择的孔道区域，有许多带电的氨基酸位点，它们可能在Ca2+的通透性功能上起着总要的作用。为了证明此假设，我们将此区域的每个带电氨基酸位点突变成电位相反或中性的氨基酸，并测量它们的Pf，我们发现TRPV2通道的Glu594和Glu604位点，对生理溶液条件下对Ca2+通透性起着关键的作用。与此同时，TRPV1通道中相应的氨基酸位点（Glu636和Asp646）也有着类似的对Ca2+通透性的关键作用。有趣的是，我们发现Glu604（TRPV2）和Asp464（TRPV1种相应位点）是决定TRPV2和TRPV1两种相似通道Pf有着巨大差异的关键氨基酸。我们的发现描述了TRPV2/1的孔道区域并对它们离子通透通路架构有着初步的了解。另外，使用TRPV1-/-小鼠，我们发现Pf是神经分泌的重要影响因素。