抗菌肽Apidaecin抑制革兰氏阴性菌E.coli的分子机制研究

来源于昆虫的抗菌肽Apidaecin对E.coli等革兰氏阴性菌具有特异性的杀伤作用，揭示其抑菌分子机制可为Apidaecin类抗菌肽应用于畜牧业以解决畜产品中抗生素残留问题提供重要的理论依据。已有研究表明，热应激蛋白DnaK是Apidaecin作用于E.coli的重要靶蛋白，但对其作用位点和效应蛋白仍不清楚。鉴于此，本项目拟采用蛋白质组学技术，结合原子力显微镜、共聚焦/荧光非损伤检测、荧光偏振和圆二色谱等方法，探明Apidaecin作用于DnaK蛋白的位点及其下游效应蛋白，并对其中1-2个典型效应蛋白的mRNA表达水平进行阐析，旨在揭示Apidaecin抑制革兰氏阴性菌E.coli的分子机制。研究结果将进一步充实和完善抗菌肽的抑菌理论，并促进蛋白质组学技术在动物营养与饲料科学领域的研究和应用，对研发具有自主知识产权的原创性生物型饲料添加剂产品具有重要意义。

抗菌肽详细抗菌机理的阐明是通过分子设计提高其活性的重要理论依据。Apidaecin是来源于昆虫的一类富含脯氨酸的抗菌肽，对E.coli等革兰氏阴性菌具有特异性的杀伤作用。本项目以揭示Apidaecin抑制E.coli的分子机制为出发点，采用蛋白质组学技术，结合原子力显微镜、共聚焦/荧光检测和圆二色谱等方法重点对Apidaecin作用于热应激蛋白（DnaK）的位点及其下游效应蛋白进行了研究。结果表明：在原子力显微镜下观察，经最小抑菌浓度Apidaecin处理4h的大肠杆菌K88细胞形态和外膜未观察到明显的变化，也没有发生胞浆内容物的外流，而且胞内外的Ca2+、H+、K+和Na+离子浓度均没有显著变化，提示Apidaecin对大肠杆菌的作用方式为抑菌为主，并不表现出细胞的损伤和死亡症状，且其发挥作用与细胞膜离子通道没有直接关系。CD谱测定表明， apidaecin 不与DnaK蛋白的 D-E 螺旋作用，而能够与DnaK蛋白的基质结合位点作用，表现为明显增加 E.coli DnaK蛋白的ATPase活性，并显著抑制细胞β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶活性。差异蛋白质组学研究表明，apidaecin处理的E.coli K88总蛋白存在9个差异蛋白质点，其中7个蛋白质表达下调，2个蛋白质表达上调。其中表达上调的蛋白分别与寡肽透过酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、腺苷脱氨酶和磷酸果糖激酶等的同源性最高；而表达下调的蛋白推测为DNA结合反应调控蛋白和SET蛋白。进一步的荧光定量PCR也表明寡肽转运系统透过酶蛋白oppB基因和腺苷脱氨酶蛋白add基因表达水平均明显下降，与蛋白质组学的结果相一致。此外，本项目还发现，通过氨基酸替换改变Apidaecin的亲水和疏水性可以改变其抑菌谱和抑菌活性。综合以上研究结果，分析Apidaecin作用机理为：Apidaecin 通过与DnaK蛋白的基质结合位点结合，并通过与基质竞争该位点而降低DnaK蛋白在细胞内的实际浓度，抑制E. coli的β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶等的活性，并改变细胞肽类和腺苷代谢相关蛋白的表达，干扰细胞的正常代谢，而最终引起细胞死亡。本项目的实施丰富了抗菌肽的抗菌机理，为进一步通过分子设计获得高抗菌谱和活性的抗菌肽提供了理论依据，对研发具有自主知识产权的原创性抗菌肽类产品具有重要意义。