六价铬诱发DNA甲基化异常的体外实验研究及在人群调查中的应用

本项目将体外实验和人群调查相结合来研究不溶性六价铬盐诱发DNA甲基化异常的生物标志物。(1) 体外实验，人B淋巴母细胞系暴露不溶性铬盐后，用甲基化芯片筛测基因组DNA启动子区甲基化的异常表达。分别用甲基化特异性PCR、RT-PCR和western blot对芯片结果进行验证，筛选出与甲基化异常表达有关的生物标志物。(2) 人群调査，体外实验筛选出的生物标志物在铬暴露人群中进行验证，比较暴露人群与对照人群这些生物标志物表达的差异，检测环境铬外暴露水平、暴露人群铬内暴露标志及外周血淋巴细胞DNA损伤程度，并分析DNA甲基化及相关生物标志物与铬暴露水平及暴露效应之间的相关性，综合评价铬诱发的DNA甲基化异常表达及其相关生物标志物作为六价铬暴露人群效应生物标志的可能性，获得可用于六价铬暴露人群健康效应监测的DNA甲基化位点。

本项目利用DNA甲基化芯片比较研究了可溶性和不溶性六价铬化合物对人B淋巴母细胞系DNA甲基化谱的影响，发现两者均诱发了约40个差异DNA甲基化位点，并有15个共同差异位点，基因表达验证发现mRNA表达与DNA甲基化改变并非完全一致。同时，体外实验研究了p16基因及全基因组DNA甲基化在六价铬致细胞周期阻滞中的作用，发现全基因组低甲基化与G1期细胞周期阻滞有关，六价铬可通过上调p16基因表达而抑制CDK4/CDK6基因的表达，从而将细胞阻滞在G1期，但p16基因表达上调可能通过非DNA甲基化途径。动物实验研究发现饮水暴露六价铬可致大鼠外周血DNA损伤增加、血浆中8-OHdG和MDA的含量升高、基因组DNA总甲基化水平降低，但对p16基因DNA甲基化状态无明显影响。人群研究发现电镀工血铬明显高于对照，而血浆GSH水平明显低于对照，P16基因启动子区甲基化率明显高于对照，血浆P16蛋白表达水平虽与对照有差异，但无统计学意义。因此，p16基因启动子区DNA甲基化率可能作为六价铬暴露人群健康效应监测。