锌指蛋白RN181抑制肝癌细胞生长机制研究

肝癌是严重威胁人类健康的疾病，对进展期肝癌目前尚无有效的治疗方法。Sorafenib分子靶向治疗给肝癌患者带来新的希望。RN181是一个新的C3HC4型锌指蛋白，2008年首次被Brophy等证实具有E3酶活性。我们的研究首次发现，RN181低表达于肝癌组织而高表达于正常肝组织；在肝癌细胞中，该分子能通过MAPK-ERK途径抑制癌细胞的增殖和成瘤，提示RN181可能是一个新的抑癌分子。然而，RN181抑制肝癌发生发展的分子机制，目前尚未知晓。因此，本项目在我们前期研究的基础上，拟以肝癌为研究对象，采用蛋白质组学分析技术、免疫共沉淀、酵母双杂交、报告基因系统和质谱分析等现代实验方法，对RN181在肝癌细胞中的转录调控过程、RN181的相互作用蛋白以及RN181酶底物的调控关系，进行系统研究，旨在阐明RN181在肝癌中的抑癌机制，为深入了解肝细胞癌变机制、为研发新的靶向治疗提供新思路。

肝癌是严重威胁人类健康的疾病，对晚期发生转移的肝癌目前尚无有效的治疗方法。锌指蛋白参与众多重要的生物学过程，包括癌症的发生发展。RN181是一个新的C3HC4型锌指蛋白，我们2011 年首先报道它可能是一个新的抑癌分子：RN181低表达于肝癌组织而高表达于正常肝组织，通过MAPK-ERK途径抑制肝癌细胞的体外生长和体内成瘤。然而，RN181抑制肝癌发生发展的分子机制，目前一无所知。因此，本项目在我们前期研究的基础上，结合体外细胞培养、体内动物转移模型和临床肿瘤标本，采用蛋白质组学技术、IPA（Ingenuity Pathway Analysis）分析、免疫共沉淀、酵母双杂交以及PLA（Proximity Ligation Assay）等实验方法，研究RN181在肝癌发生发展中的作用。实验结果显示：.1，免疫组化分析了RN181的表达与肝癌/肠癌/胃癌的关系。.2，在体外，采用CCK8增殖检测实验，发现高表达RN181抑制肝癌细胞SMMC7721/Bel7402/QGY7703SK-Hep-1等细胞的增殖。而下调RN181的表达能够促进细胞的增殖。在体内，利用皮下成瘤小鼠模型观察RN181对肝癌细胞生长的影响，结果显示，无论是在SMMC7721细胞中还是在SK-Hep-1细胞中，高表达RN181抑制肝癌细胞的体内生长而干扰RN181则是促进生长。.3，采用RNA-seq以及基于SILAC标记-蛋白表达谱分析，差异结果用IPA软件分析。结果表示，RN181相关的蛋白参与众多信号途径的调控，包括MAPK-ERK，NF-kB，AKT，caspase凋亡等途径。而且，RN181能够通过调节NF-KB调节细胞的 。.4，酵母双杂交和免疫共沉淀实验寻找RN181的相互作用蛋白，结果显示，RN181可以和UBE2V1/UBE2V1以及RPS3/RPS27a等蛋白发生相互作用。而UBE2V1/UBE2V1以及RPS3/RPS27a等蛋白均能调节肝癌细胞的生长。而且，UBE2V1/UBE2V1以及RPS3都能调节NF-kB信号途径的活性。因此，RN181有可能能够通过UBE2V1/UBE2V1或RPS3对NF-kB信号通路的调节从而调节肝癌细胞的生长。.5，为了更深入地揭示RN181的生理功能和它在肝癌发生发展中的作用，我们还通过TALEN的方法构建了RN181的基因敲除小鼠模型。