重度冷应激下民猪和大白猪Foxn1的表达及调控机制

One important feature of severe cold-stress on immune organs is thymic atrophy, thymocyte apoptosis, and arounding lymphocytes number decreased. In preliminary studies, we found that the Large White thymus was damaged under severe cold-stress, but Min pig thymus was not. Foxn1 is a number of the wing-shaped helix / forkhead transcription factor family. The Foxn1 gene mutation or deletion in human and mouse can cause the thymus serious obstacles or missing. This transcription factor plays an important role in the maintenance of thymocytes and support of T cell development. Accordingly, we made the following assumptions: Under the severe cold-stress, the expression of Large White Foxn1 was inhibited; there was difference in gene sequence or transcriptional regulation between Large White and Min pig. To confirm this hypothesis, the expression level of Foxn1 in transcription, translate, and cell level were detected and comparative. Analyzed the sequence variation of Foxn1 between two pig breed. Screening and identification of Foxn1 transcription factor, dected the expression chage of them after severe cold-stress. Our purpose is to determine the expression change and transcriptional regulation mechanism of Foxn1 in pig and discuss the molecule mechanism of Min pig cold stress resistance.

胸腺萎缩，胸腺细胞凋亡，其周围淋巴细胞数目减少是重度冷应激对机体免疫器官造成损伤的一个重要特征。申请人在前期研究中发现重度冷应激会对大白猪的胸腺造成损伤，而对民猪胸腺则无显著影响。Foxn1是翼状螺旋/叉头型转录因子家族的一员，人类和小鼠Foxn1基因突变或缺失可引起胸腺发育严重障碍或缺失，该转录因子在维持胸腺细胞，支持T细胞发育中起着重要作用。据此我们提出如下假设：重度冷应激下，大白猪Foxn1的表达受到抑制；民猪和大白猪的Foxn1存在基因序列或转录调控差异。为证实这一假设，本项目拟在转录、翻译及细胞水平上对重度冷应激后，民猪和大白猪Foxn1的表达水平进行检测与比较；对两猪种Foxn1的序列差异进行分析；筛选和鉴定Foxn1的转录调控因子，并检测它们在重度冷应激后的表达变化情况。旨在揭示重度冷应激下猪胸腺Foxn1的表达变化及转录调控机制，探讨民猪具有抗有抗寒特性的分子机理。

本课题组多年来一直从事民猪的耐寒特性研究，在前期研究中发现，重度冷应激会造成大白猪胸腺不同程度的萎缩，而民猪无显著变化。胸腺是机体重要的淋巴器官，能够产生成熟的T淋巴细胞，也是脊椎动物一个主要的适应性免疫系统。基于前人的研究结果，发现Foxn1基因在胸腺的发育和T细胞的产生过程中起着重要作用。.本研究以猪的Foxn1基因为靶基因，克隆了其完整基因序列；分析了该基因的生物信息学特征；筛选并验证了调控其转录的反式作用因子；检测了该基因的时空表达规律；比较了该基因及其反式作用因子在不同程度冷应激后的表达变化情况。.结果发现该基因全长14,730 bp，包含8个外显子和7个内含子，同时还获得了其5’-UTR区1,000 bp序列；发现3种转录剪切变异体，其中最长变异体为1,944 bp，另外2个变异体为1,941 bp和1,677 bp。基于Foxn1基因核苷酸序列构建的分子进化树，发现Foxn1基因严格遵守了物种的进化规律。民猪与牛、水牛、绵羊、藏羚羊聚在一个大的分支上，均属于偶蹄目。对20头民猪和10头大白猪完整的CDS区序列比对发现了4个单碱基突变，其中1个属于错义突变。位于243bp和323bp处的2个SNP位点，在民猪和大白猪中的基因频率基本相同；而位于766bp和1237bp处的2个SNP位点，在民猪和大白猪中的基因频率差异较大。对Foxn1基因3中转录剪切变异体进行亚细胞定位发现，3种剪切变异体均定位为核表达。确定了转录因子SP1为Foxn1基因转录调控的反式作用因子。发现猪的Foxn1基因不仅在胸腺和皮肤表达，在舌中也有表达；在胸腺组织的表达水平，随月龄增加而增高，至4月龄达到最高，随后出现下降。冷应激（10℃左右）不会刺激民猪Foxn1基因的转录，但重度冷应激（-10℃~-20℃）会促进Foxn1基因的转录；调控Foxn1基因转录的SP1变化趋势与Foxn1基本一致。无论是轻度冷应激（10℃左右）还是重度冷应激（-10℃~-20℃）均不会刺激大白猪Foxn1基因的转录，随着冷应激程度的加强，大白猪Foxn1基因的转录甚至出现下降的趋势；大白猪胸腺组织内SP1的变化趋势与Foxn1基本一致。.本研究为今后深入研究猪Foxn1基因的作用机理提供了基本的遗传信息；间接证明了民猪的耐寒特性，可为今后系统揭示民猪耐寒特性的分子机理提供理论支持。