卷叶贝母再生鳞茎生物碱高效积累相关基因资源发掘与激素调控机理研究

Fritillaria cirrhosa D. Don is a precious source of traditional Chinese medicine of Chuan Bei Mu. Nowadays, F. cirrhosa is confronted with sharp conflictions between supply and demand. Effective ways to resolve this contradiction are needed. Steroidal alkaloids are the major effective components in F. cirrhosa. Previous research showed that the alkaloid content in regeneration bulbs induced by cytokinin and auxin was higher than that in the wild bulbs which are used as the explants. RNA-seq analysis showed differences between the regeneration and wild bulbs in expression levels of steroidal alkaloid biosynthesis pathway related genes. This project will clone the key genes in the steroidal alkaloid biosynthesis pathway and then verify their functions. We will also explore the role of hormones in the regulation of steroidal alkaloid biosynthesis by analyzing the content of metabolites and gene expression levels in the materials which cultured on the mediums with different dosage of hormones and/or inhibitors of some crucial enzymes in metabolic pathways. This will lay a foundation on obtaining alkaloids resources of F.cirrhosa by tissue culture, and explaining the synthesis mechanism of steroidal alkaloid in F.cirrhosa in further study.

卷叶贝母是中药“川贝母”的珍贵来源植物，市场需求量大但产量低，供需矛盾突出，亟需寻找资源获得的新途径。甾体生物碱是卷叶贝母的主要药效成分。前期研究表明以卷叶贝母野生鳞茎为外植体经细胞分裂素和生长素诱导的再生鳞茎中生物碱含量明显高于野生鳞茎。基于RNA-seq的通路分析表明再生鳞茎与野生鳞茎之间在甾体生物碱生物合成途径的相关基因的表达量上存在差异。本研究拟在对卷叶贝母甾体生物碱合成关键基因克隆和功能鉴定的基础上，通过对培养过程中外源激素和代谢途径关键酶抑制剂的用量变化下相关代谢产物含量和基因表达量的变化进行分析，探讨激素在卷叶贝母甾体生物碱生物合成中的调控作用，为进一步阐释卷叶贝母甾体生物碱的合成规律，通过组织培养等途径获得卷叶贝母生物碱资源奠定基础。

卷叶贝母作为提供镇咳、抗炎、抗高血压和抗肿瘤药物的天然药源，在临床医用领域应用极广。甾体生物碱是卷叶贝母的主要药效成分，但其在卷叶贝母中含量低，资源获得潜力有限。组织培养是药用成分大量、快速获得的一个有效途径，而本项目也是依此途径开展的。前期研究表明以卷叶贝母野生鳞茎为外植体经细胞分裂素和生长素诱导的再生鳞茎中生物碱含量明显高于野生鳞茎，在该项的支持下，综合运用RNA-Seq高通量测序、qRT-PCR、基因克隆和生物信息学等现代生物学技术，比较分析不同状态下鳞茎（野生与再生）转录组变化，结合生物碱含量检测结果，探讨激素在卷叶贝母甾体生物碱生物合成中的调控作用，阐释激素调控的机理。获得了以下研究结果：（1）HPLC-ELSD法测定了野生和再生鳞茎的主要药用甾体生物碱（西贝碱、贝母素甲、贝母素乙）成分含量，结果显示经激素诱导的再生鳞茎生物碱含量均高于野生鳞茎；（2）获得了与生物碱合成、激素刺激相关的差异途径和差异基因，推测出卷叶贝母甾体生物碱合成途径，其中有31个差异表达基因参与该途径，对筛选得到的基因表达量进行分析，发现绝大多数基因的表达变化规律与生物碱的成分积累情况相似（再生>野生）；（3）预测分析了候选关键酶基因（FcHMGR、FcFPPS、FcDXS及FcIDI）具有的生物学功能，经克隆验证后通过qRT-PCR技术和煎煮法检测了再生鳞茎和野生鳞茎基因表达和总生物碱含量的变化趋势，结果发现这些基因的表达水平与总生物碱含量的变化趋势一致；（4）通过两条代谢途径（MVA和MEP）的抑制剂洛伐他汀和膦胺霉素对再生鳞茎进行处理，发现卷叶贝母体内对抑制剂处理具有明显的反馈补偿作用，细胞通过增加关键酶基因的表达来抵消抑制剂的作用，初步证明两条途径对卷叶贝母生物碱的生物合成都具有贡献。本项目通过阐释激素调控卷叶贝母生物碱合成机理，为进一步开发组织培养技术、优化人工种植，拓宽卷叶贝母药用生物碱资源的获得途径奠定基础。