具有靶向性、发射红光的硫醇双光子荧光探针的设计、合成与成像研究

The abnormal levels of intracellular thiols are implicated in a number of diseases. So the real-time detection of biological thiols is of great importance. Two-photon fluorescent probe comes the ability to acquire deep penetration, reduce background fluorescence and provide high 3D temporal-spatial resolution. It gradually gains extensive attention on the detection of biothiols in the cell and even in vivo. However, there are not enough kinds of two-photon fluorescent thiol probes in literature, and most of which showed short emission wavelength and cannot detect target-specific thiols. This limits the superiority of two-photon fluorescent technique. To solve the problem, this project aims at the design and synthesis of red-emission and target-specific two-photon fluorescent probes for thiols. The molecular design strategies are as follows: the boron complex of β-diketone is selected as the strong electron-withdrawing unit to form two-photon fluorophore with large π-conjugation. Nitrobenzenesulfonic ester or acrylic ester is selected as the recognition group for thiols. Morpholine, triphenylphosphonium bromide and biotin unit are chosen as the targeting groups for lysosome, mitochondria and cancer cell respectively. As a result, the two-photon fluorescent thiol probes in this project can image the thiols in specified organelles or tissues in vivo. And this project may contribute to the development of diagnostic technique for thiol-related disease.

细胞内硫醇浓度的异常变化经常与各种疾病息息相关，因此对其进行实时检测意义重大。双光子荧光探针因具有背景噪音干扰小，三维时空分辨率高，检测深度深等特点，在细胞乃至活体组织的硫醇成像中逐渐受到广泛的关注。但文献中报道的硫醇双光子荧光探针种类较少，大多数发射波长较短，且少有能靶向检测，因此在实际应用中尚未完全发挥出双光子荧光探针本身的优势。为了解决这个问题，本项目以设计和合成能发射红光、靶向性强的硫醇双光子荧光探针为目标，采用的分子设计策略是：以β二酮的硼配合物为强受体构筑大π共轭体系作为双光子荧光团，以硝基磺酸酯或者丙烯酸酯为反应位点构筑硫醇的识别基团，以吗啉、三苯基膦盐和生物素分别作为溶酶体、线粒体和癌细胞的靶向基团，合成出具有特殊意义的探针，使之能在特定的细胞器或是活体较深组织处内对硫醇进行靶向成像，监测硫醇浓度的变化，为最终开发出与硫醇浓度息息相关的疾病的诊断手段做出贡献。

生物硫醇，包括半胱氨酸，高半胱氨酸和谷胱甘肽，不仅是很多多肽的重要组成部分，而且参与维持了生物体内的氧化还原平衡稳态，在一系列生理和病理活动中发挥了重要作用，其浓度的异常变化往往与很多疾病息息相关，因此，在活细胞内对硫醇进行选择性检测，监测其浓度的变化，对相关疾病的诊疗具有重要意义。本项目从结构−性能关系着手，分别从荧光团、识别基团、和定位基团的选择上来开发并优化探针分子，以得到具有靶向性的红光探针，并将其用于活细胞乃至细胞器中内源性硫醇分子的单光子或双光子成像。我们考察了以给体-受体-给体型荧光团构建荧光探针的策略（CBFB和CBFA），发现此类荧光团具备较大的共轭体系，很容易发射红光信号，但需要在两个给体上同时连接上识别基团，以降低探针的背景荧光噪音；我们以强缺电子基团TCF为受体构建了给体-受体型红光探针DNT和ANT，探针识别硫醇后，最大发射波长达640nm，斯托克斯位移高达160nm，在应用中能显著降低探针自吸收和生物背景荧光的干扰；我们以高荧光量子产率的氨基萘酮为荧光团，以酯基活化的α,β-不饱和酮为识别位点构建了荧光探针MANK，实现了对生物浓度范围内半胱氨酸的选择性快速识别；进一步将吗啉作为定位基团，将吡啶活化的α,β-不饱和酮作为识别位点构建了双光子荧光探针MNPO，对半胱氨酸的响应只需5分钟，荧光开启比例高达136倍，识别后荧光产物的双光子活性吸收截面值达25GM，该探针在细胞中应用时只需250nM，在双光子的激发下即可清晰的点亮溶酶体内的半胱氨酸，且信号在组织内穿透深度可达184μM；进一步地，通过改变吡啶接入分子的位置来调控识别位点的反应能力，经结构筛选得到探针p-MNPy，实现了细胞内双氧水诱导的氧化应激下谷胱甘肽的可逆性检测。我们在硫醇探针的研究中所总结的分子设计规律和成像应用经验，对于最终开发出能用于临床疾病诊断的工具具有重要意义。