海藻糖-6-磷酸合酶基因在弱光诱导的荷花花芽败育中的功能分析

Asian Lotus (Nelumbo nucifera Gaertn), one of most famous flowers of China, has high cultural, ornamental and economic values. Lotus is a kind of heliophilous flower. Low light conditions could induce flower bud abortion and failure of flowering, which largely prevented its extensive cultivation and application. A preliminary study of flowering, development of the flower bud and transcriptome analysis in lotus under low light condition showed that trehalose-6-phosphate synthase gene (TPS) might involve in regulating lotus flower bud abortion under low light condition. In this proposal, we planned to clone TPSs gene family, study the subcellular localization, expression pattern and their function in lotus under low light condition. Real-time PCR, bio-information analysis and promotor analysis will be used for the expression pattern. We will determine the subcellular localization of TPS and provide yeast evidence specifically for TPS function in a heterologous expression system. The function of TPSs gene family will be further determined with over-expression and RNAi transgenic plants. Consequently, the proposal on functional characterization of lotus TPSs gene family with regard to its role in controlling lotus flower bud abortion under low light condition is very important to understand the mechanism of lotus shade tolerance and will lay the foundation for lotus germplasm enhancement.

荷花是中国十大传统名花之一，具有很高的观赏、经济和文化价值。荷花属于喜光花卉，极不耐阴暗。弱光下花芽易败育，无法开花，极大影响了它的广泛应用和家庭栽培。我们前期通过对遮阴处理下荷花的花芽发育、生理和基因表达谱变化的研究，发现海藻糖-6-磷酸合酶基因（trehalose-6-phosphate synthase, TPS）极有可能在弱光诱导的荷花花芽败育中发挥重要作用。为此，本申请项目拟从荷花中克隆TPSs家族基因，通过生物信息学分析、基因时空表达特性、启动子克隆与顺式作用元件分析阐述其在遮阴处理下转录水平与调控特性；通过亚细胞定位分析及酵母异源表达初步阐述其功能；利用超表达和RNAi技术获得转基因的荷花/拟南芥，阐述不同基因家族成员在弱光诱导的荷花花芽败育中的功能与作用机理。本申请项目的实施可丰富荷花耐阴的分子机理，为培育高耐阴性荷花的生物技术育种提供基础。

弱光下荷花花芽易败育、无法开花，极大影响了它的广泛应用和产业价值。海藻糖-6-磷酸合酶基因家族在植物感受碳水化合物可利用率，调控花发育、细胞PCD等方面发挥重要作用。项目从荷花海藻糖-6-磷酸合酶基因家族成员（NnTPSs）的全基因组鉴定入手，对NnTPSs基因家族成员进行了克隆、亚细胞定位、系统的进化分析与功能推断。通过转录组及RT-qPCR分析，检测了NnTPSs在不同品种、组织器官及处理下的表达特点。探索了TPS基因在水淹诱导的弱光环境下的及在其他植物中的表达模式。结合荷花在不同逆境下的转录组，我们借助加权基因共表达分析的方法对不同胁迫下的NnTPS基因进行了分析，鉴定到一个以NnTPS1为核心基因的亚网络和遮阴处理显著相关，暗示其为荷花响应弱光的关键候选基因。通过同源重组的方法，我们构建了酵母TPS1突变株，通过回补实验验证其为有功能的TPS基因。我们随后从生理、分子及遗传学角度验证NnTPS1弱光诱导在荷花花芽败育中的功能。生理数据显示TPS基因的诱导剂蔗糖含量受遮阴度影响最大。多个证据显示细胞凋亡是弱光引起花芽败育的主要原因。而组学数据揭示引起细胞凋亡的重要基因SNRK1在弱光及其他胁迫下和TPS1呈现出相反的表达模式，结合分子、生理及遗传学数据显示TPS1表达量的下降减弱了对SNRK1的抑制可能是诱导荷花花芽败育主要原因。此外，组学联合分析显示miR156可能参与TPS的调控网络。通过进一步对荷花miR156家族进行系统分析，发现miR156g-3p可能参与到NnTPS1的作用信号途径中。我们随后在烟草中过表达了NnTPS1基因，转基因苗表现出更强的开花能力，败育的发生率显著下降，而SNKR1及miR156g的过表达导致花芽败育率明显增加。我们首次在荷花中建立了基于双生病毒的长效表达系统，并在荷花中进行了初步的验证，得到类似的结果。结合以上数据我们提出了TPS1在调控荷花花芽败育中的作用模型，并开发出提高荷花耐阴性的针剂。项目结果为解决弱光下荷花花芽易败育、耐阴性差等问题的分子育种和生长调节剂开发提供思路，具有一定的理论意义和应用价值。