HPV58型T细胞表位筛选及HPV16/18/58三价治疗性DNA疫苗构建及其免疫效果的研究

Human papilloma virus type 58 ( HPV58 ) has high infection rate in Chinese patients with cervical cancer, following only HPV type 16 and 18 . Due to the carcinogenic mechanism and epitopes is not clear, so constructing HPV58 vaccine and detecting its immune effects are very difficult. Earlier we have constructed mutation of HPV58E6E7 fusion gene and human granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF ) combined expressing gene vaccine, but also built a stable expression of HPV58E6E7 fusion protein in mice tumor cell lines and purified the fusion protein HPV58E6E7-GST, detected preliminary immune effect of the vaccine. This time we will study the relationship between cervical cancer patients infected by HPV16, 18, 58 and the changes of their immune factors especially interleukin 12 ; screening and preliminary identification of HPV58E7 antigen HLA-A2 restriction of cytotoxic T lymphocyte epitopes; finally we will construct a new trivalent DNA vaccine with HPV16, 18, 58 mE6E7 genes and interleukin 12 combined expression, observe its immune effect，for the future therapy of cervical cancer and provide a theoretical basis and experimental base.

人乳头瘤病毒58型（HPV58）在中国宫颈癌患者中存在高感染率，仅次于HPV16和18型。由于其致癌机制及抗原表位不清，所以构建HPV58型疫苗及检测其免疫效果困难。前期我们成功构建了将突变后的HPV58mE6E7融合基因与人粒-巨细胞集落刺激因子（GM-CSF）联合表达的基因疫苗，同时还构建了稳定表达HPV58E6E7融合基因的小鼠肿瘤细胞株及纯化了HPV58E6E7-GST融合蛋白，初步了解该疫苗免疫效果。本项目将研究HPV16，18，58型感染与宫颈病变及宫颈癌患者机体免疫因子尤其是IL12变化之间的关系；筛选及初步鉴定出HPV58E7抗原HLA-A2限制性细胞毒性T淋巴细胞表位； 最终构建HPV16，18，58 mE6E7基因与白介素12（mIL12）联合表达的新型三价治疗性DNA疫苗，观察其免疫效果；为今后宫颈癌的免疫治疗提供理论依据和实验基础。

子宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率在女性恶性肿瘤中居第二位，仅次于乳腺癌。流行病学资料显示：90%以上的宫颈癌中存在高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）感染，HR-HPV持续感染是宫颈癌发生的首要因素且为始动因素。而宫颈微环境中免疫因子及宫颈细胞中病毒整合的变化，也会协同HR-HPV持续感染，共同影响着宫颈癌及癌前病变的发展。人乳头瘤病毒58 型（HPV58）在中国宫颈癌患者中存在高感染率，仅次于HPV16 和18 型。但因其致癌机制及抗原表位不清，所以构建HPV58 型疫苗及检测其免疫效果困难。本研究（1）通过分析HPV16，18，58 型感染与宫颈病变及宫颈癌患者机体免疫因子尤其是IL12变化之间的关系，得出宫颈HPV16、18、58感染不但导致宫颈局部微环境中的IL-4的浓度明显升高而IL-12、IFN-γ的浓度明显降低，还可以导致病毒在宫颈细胞内整合，且随着宫颈病变程度的增加，病毒整合比率及病毒负载量也逐渐增大；HPV16型较HPV58型更容易造成宫颈微环境中的免疫因子变化及HPV病毒整合及病毒负载量的升高，从而更容易导致宫颈组织发生癌变的结论。（2）构建及包装了过表达HPV58E6E7融合基因的重组慢病毒颗粒LV-HPV58E6E7，并先后以此建立及验证了稳定表达HPV58E6E7融合基因的人宫颈癌细胞株C33A/LV-HPV58E6E7及小鼠宫颈癌细胞株U14/LV-HPV58E6E7，为后续的抗原表位筛选及疫苗的免疫学检测提供了靶细胞。（3）运用计算机软件及生物信息学方法筛选出HPV58 E6和E7 HLA限制性细胞毒性T淋巴细胞表位并进行了初步鉴定。（4）构建了新型三价治疗性腺病毒载体疫苗AD-HPV16/18/58mE6E7 并实现其真核表达，目前正在进行动物实验以评价其免疫效果，后续携带分子佐剂IL-12的三价治疗性腺病毒载体疫苗也正在构建中。通过本研究，为今后相关研究提供了候选的HLA限制性细胞毒性T淋巴细胞表位及HPV16/18/58三价治疗性HPV疫苗，更为后续研究提供了理论依据及实验基础。