赖氨酸和蛋氨酸平衡对JAK2-STAT5和mTOR信号通路基因DNA甲基化影响的研究

The level, the conbination and the ratio of lysine and methionine can change the casein synthesis via promoting the cell proliferation and changing the expression of members in JAK2-STAT5 and mTOR signal pathway in the levels of transcription, translation and post translational modifications. To study the effects of the balance between lysine and methionine on DNA methylation of genes in JAK2-STAT5 and mTOR pathway, methylation specific PCR method, transmission electron microscopy method and mRFP-GFP-LC3 reporter system were chose to difine the changes of DNA methylation of genes in JAK2-STAT5 and mTOR pathway, the changes of organelles and the autophagy flow in the groups treated with lysine and methionine at different level and ratio. Basing on the results, whether Lys, Met or their combination can change the casein synthesis via the DNA methylation could be defined and which would be helpful for the improvement of the production performance via supplying the theoretical support and practice reference.

赖氨酸和蛋氨酸的浓度水平、组成和比例能够改变奶牛乳腺上皮细胞增殖，并在转录、翻译和翻译后水平调控JAK2-STAT5和mTOR信号通路主要调节因子的表达，从而影响酪蛋白的生成。为了研究赖氨酸和蛋氨酸平衡性对JAK2-STAT5和mTOR信号通路基因DNA甲基化的影响，本研究以乳腺上皮细胞为模型，使用甲基化特异性PCR方法、透射电镜方法以及 mRFP-GFP-LC3双荧光素指示体系检测不同浓度与配比蛋氨酸、赖氨酸处理组中JAK2-STAT5和mTOR信号通路基因DNA甲基化、细胞器数量的变化及自噬流的走向，确定此时的细胞生理状态。从而确定DNA甲基化是否是限制性氨基酸赖氨酸和蛋氨酸及其组成改变酪蛋白生成的因素之一，为营养成分更好的优化生产性能，提供有力的理论依据和实践参考。

赖氨酸、蛋氨酸平衡能够通过改变奶牛乳腺上皮细胞数及调控乳蛋白合成相关信号通路影响乳蛋白生成。但是，鉴于氨基酸能够通过改变基因甲基化修饰影响基因表达，Lys、Met能否在DNA水平改变JAK2-STAT5和mTOR信号通路相关基因的甲基化修饰尚不明确。本研究通过细胞培养、透射电镜、mRFP-GFP-LC3双荧光素指示体系、亚硫酸氢盐测序PCR法、western blot等方法研究Lys和Met的浓度及平衡性对乳腺上皮细胞细胞器数量、自噬流及乳蛋白生成转录及翻译过程中主要信号通路相关基因的甲基化进行检测，结果表明Lys、Met失衡能够显著提高mTOR基因CpG岛DNA甲基化程度，平衡组与对照组相比差异不显著。Lys、Met平衡组各培养时间细胞结构完整，细胞表面绒毛丰富，细胞器形态正常，细胞核完整，自噬体数量较少，而失衡组细胞表面绒毛有部分不连续，自噬体数量显著增加。与平衡组相比，Lys、Met失衡组P62蛋白相对表达显著，LC3-II、I蛋白比值显著上调，提示Lys、Met失衡造成乳腺上皮细胞自噬，从而改变乳蛋白合成。使用雷帕霉素处理细胞后发现，Lys、Met平衡组mTOR表达下调，对营养匮乏情况下细胞的保护作用消失，自噬发生增加，表明Lys、Met主要是通过mTOR信号途径影响细胞自噬。研究证实，DNA甲基化是限制Lys、Met比例改变乳蛋白生成的因素之一，而氨基酸的平衡性对于细胞个体的亚细胞形态也有显著作用，Lys、Met比例失衡可以通过mTOR信号通路影响细胞内自噬的发生，从而改变乳蛋白生成。该研究揭示了氨基酸配比模式影响乳蛋白生成的深层机制。