NAD+在DNA损伤引起的细胞死亡中的作用及其机制研究

细胞死亡异常是自身免疫病脏器损伤的主要原因。目前公认的Okamoto学说认为：损伤引起细胞DNA链断裂，进而激活PARP以NAD+为底物进行修复，PARP过度激活导致NAD+耗竭，细胞在合成NAD+的过程中因能量衰竭而死亡。CD38表达于各种细胞，底物也是NAD+。CD38通过消耗NAD+调控细胞内外NAD+水平。研究证明CD38基因敲除小鼠脏器与血清内NAD+水平明显升高。依照Okamoto学说，CD38基因敲除后，NAD+水平增高，损伤刺激下细胞死亡应该减少，但我们的预实验发现CD38基因敲除后虽然NAD+水平增高，细胞死亡反而增加，说明细胞内补充NAD+并不能挽救DNA损伤引起的细胞死亡。本课题将利用CD38基因敲除小鼠MEF细胞深入研究NAD+在损伤导致细胞死亡过程中的意义，探寻细胞死亡非NAD+途径的信号通路，进而为研究自身免疫病发病机制，寻找干预自身免疫病的新靶点提供理论依据。

本实验利用CD38-KO小鼠和相同基因背景WT小鼠进行实验，在确定CD38-KO为纯合子基因型小鼠后，首先测定MEF细胞内NAD+水平，结果发现CD38-KO MEF细胞内NAD+水平明显高于WT；用0.4mM浓度H2O2刺激后发现CD38-KO组NAD+水平仍然明显高于WT。再用多种浓度H2O2刺激两组细胞死亡，发现CD38-KO MEF细胞死亡数量均较WT明显增加。上述结果提示CD38-KO MEF细胞内NAD+水平在受到DNA损伤刺激时是增高的，按照Okamoto学说应该推论出CD38-KO组NAD+较WT组更不易耗竭，细胞死亡数量应该较WT组少，但实验结果却相反，发现CD38-KO组细胞死亡较WT组明显增加。由此，我们推测DNA损伤所致细胞死亡的原因并非NAD+耗竭，NAD+在DNA损伤所致的细胞死亡中不扮演重要角色。继而，采用不同浓度 H2O2刺激下CD38-KO和WT MEF细胞内PARP活性测定，以及加用PARP抑制剂DPQ后不同浓度H2O2刺激细胞死亡实验。结果发现CD38-KO和WT细胞内PARP活性随着H2O2浓度的递增而增高；CD38-KO 的PARP活性，在各H2O2浓度组均较WT高。加用DPQ后CD38-KO在各浓度H2O2组细胞死亡数量均分别较无DPQ刺激时明显减少。结果提示DNA损伤刺激越强，PARP活性越强，细胞死亡数量越多；加用DPQ后，PARP活性减少，细胞死亡数量明显减少。由此可见，PARP激活与细胞死亡密切相关。最后，测定0.4mM H2O2刺激下CD38-KO和WT MEF细胞内重要抗凋亡分子pAKT-ser473和BCL-xl水平，发现pAKT-Ser473在CD38-KO组表达明显弱于WT组，BCL-xl在两组间表达差异无统计学意义。加DPQ后，pAKT-Ser473在CD38-KO组表达较不加DPQ时明显增加，加DPQ后，pAKT-Ser473在CD38-KO组和WT组表达差异无统计学差异，BCL-xl在CD38-KO和WT组加DPQ前后均无明显变化。上述结果提示H2O2刺激下PARP过度激活后通过下调抗凋亡分子pAKT-Ser473的表达来促进细胞凋亡，而不通过调节抗凋亡分子BCL-xl的表达来调控凋亡。