缺氧炎症微环境中肝癌细胞上皮间质转化相关基因甲基化的变化及作用机制

High metastatic recurrence characteristics of hepatoma affect the long-term treatment. Tumor recurrence and metastasis is closely related to the tumor microenvironment, which has two significant characteristics: hypoxia and inflammation. Our previous study showed that: hypoxia and inflammatory factors could significantly promote the epithelial-mesenchymal transition (EMT) of hepatoma cells. Hypoxia and inflammation can regulate DNA methylation of tumor; however, the effect of hypoxia combined with inflammation factor on EMT related-gene methylation in hepatoma cell is not yet clear. On the basis of these clues, this topic is intended to study the effect of hypoxia combined with inflammation factor on hepatoma EMT as well as invasion and metastasis by using transwell, wound healing assay and nude mouse tumor metastasis model; EMT related-gene methylation is detected by high-throughput DNA methylation microarray and confirmed by MSP, which to explore the molecular mechanism of EMT related-gene methylation regulated by hypoxia combined with inflammation factor; Further study the relation of screened methylation sites and clinical prognosis in the clinical specimens. The results of this study cannot only deepen our understanding of tumor microenvironment and tumor metastasis, recurrence, but also provide the experimental basis for exploring the new strategy of anti-tumor metastasis aiming at microenvironment.

肝癌高转移复发的特性是影响其远期疗效的主要瓶颈。肿瘤的转移复发与微环境密切相关，局部缺氧及炎症是肿瘤微环境最显著的两个特点。我们前期研究发现：缺氧和炎症因子都能明显促进肝癌细胞上皮间质转化（EMT），而缺氧和炎症又可以调控肿瘤细胞的DNA甲基化，但缺氧联合炎症因子对肝癌细胞EMT相关基因甲基化的影响目前仍未明确。本课题拟在这些线索的基础上，采用Transwell、划痕实验及裸鼠肝癌转移模型等方法，研究缺氧联合炎症因子对肝癌细胞EMT及侵袭转移能力的影响；用高通量DNA甲基化芯片筛选肝癌细胞EMT相关的差异基因，并采用MSP鉴定，探讨缺氧联合炎症因子对肝癌细胞EMT相关基因甲基化调控的分子机制；结合临床标本，进一步研究肝癌组织中筛选出的甲基化位点与临床预后的相关性。本研究结果不但可以加深对肿瘤微环境影响肿瘤转移复发机制的理论认识，同时将为探索针对微环境的抗肿瘤转移复发新策略研究提供实验基础。

本课题在前期研究基础上，围绕肿瘤微环境与肿瘤侵袭转移为中心，通过研究炎症、缺氧等肿瘤微环境对肝癌细胞上皮间质转化（EMT）及肝癌转移复发的影响，并分析相关分子甲基化水平变化，探讨与肝癌病人预后的相关性。我们课题组一系列研究结论表明，肝癌的发生发展、转移复发与肿瘤微环境及肝癌干细胞密切相关，炎症、缺氧、缺血及间质细胞都是肿瘤微环境的重要特征，不但按原定计划进度正常进行，并在其基础上做了增补，实现了预期目标，完成了以下主要研究任务：（1）我们研究证实门脉系统中的炎症相关分子——LPS在肝脏受损时往往异常增高，因此其在肝癌发生发展过程中的作用越来越被重视，我们不但证实LPS可以诱导肝癌发生EMT，促进其侵袭转移，还证实该分子的受体TLR4在肝癌干细胞中高表达，可能是肝癌干细胞的新型标志物；（2）揭示了具有EMT表型的肿瘤细胞呈现出一定的肿瘤干细胞特性，如克隆形成能力、皮下成瘤能力等，体外模拟缺氧、缺营养微环境，发现肿瘤干细胞更能适应缺氧、缺营养等肿瘤微环境，其具体机制可能与其自身高自噬水平有关；（3）肿瘤微环境中的间质细胞，如肿瘤相关巨噬细胞、星状细胞等，不但可以诱导肿瘤细胞上调EMT转录基因的表达（Snail、Twist等），还可以维持其干细胞特征，具有一定的治疗抵抗特性；（4）肝癌干细胞中转移相关分子Line-1呈去甲基化水平，通过对患者生存率的分析，研究发现Line-1去甲基化与患者预后差密切相关，显示Line-1去甲基化有可能作为肝癌患者治疗预后的指标之一。因此，肝癌干细胞可能通过调控转移相关分子Line-1甲基化水平参与肝癌侵袭转移，并与患者预后密切相关，从一个新的角度证实了肿瘤微环境对肝癌侵袭转移的影响及其对转移相关分子表观遗传学的调控。以上研究结果不但可以加深对肿瘤微环境影响肿瘤转移复发机制的理论认识，同时将为探索针对微环境的抗肿瘤转移复发新策略研究提供实验基础。.本课题原计划发表SCI论文1-2篇，现已发表SCI论文8篇，均标注有本项目资助，总影响因子达31.917分；部分相关研究内容获得上海市科学技术进步奖二等奖；课题总共计划培养研究生1-2名，目前已培养硕士研究生3名，博士研究生1名。