转录因子Klf15介导脂筏蛋白Flot2保护足细胞的机制研究

Recent studies demonstrated that lipid rafts play a key role in podocyte injury, but the underlying mechanisms are unclear. We previously found that the protection of lipid raft associated protein Flot2 on podocyte via locating slit membrane protein in rafts, however, the upstream regulation of Flot2 is not fully understood. Klf15 is a kidney-enriched transcription factor. Our preliminary results found that: ①the protein expression of Klf15 is decreased in podocyte in human proteinuric diseases. ②Klf15 silencing reduced the protein and mRNA expression of Flot2 and rafts on podocyte, accompanied by the destruction of cell structure. Therefore, we proposed that the protection of Klf15 on podocyte via regulating lipid raft associated protein Flot2.Klf15 transfection and interference in vitro and podocyte Klf15 conditional knockout were used for exploring its impact on the expression of Flot2 and distribution of slit membrane protein in rafts; direct target relationship between Klf15 and Flot2 was identified by ChIP and mutation technology. This study is expected to reveal the upstream regulation of Flot2 and a new mechanism of podocyte injury and repair, and provide new targets and scientific basis for intervention for chronic kidney disease.

脂筏在维持肾小球足细胞正常的结构和功能中发挥着重要的作用。我们前期研究发现脂筏蛋白Flot2可通过维持裂孔隔膜蛋白podocin、nephrin、CD2AP在脂筏中的定位保护足细胞，但Flot2的上游调控机制有待阐明。我们进一步研究发现：①在人类肾小球疾病患者的足细胞及体外诱导足细胞损伤时，转录因子Klf15表达下降；②沉默Klf15，Flot2的表达降低，脂筏明显减少，细胞骨架紊乱。由此我们推测：转录因子Klf15可通过调控脂筏蛋白Flot2保护足细胞。本项目拟通过Klf15体外转染和干扰的足细胞及足细胞条件性敲除Klf15的小鼠模型，探索其对Flot2的调控及裂孔隔膜蛋白在脂筏中分布的影响，通过ChIP、突变技术，获得Klf15直接调控Flot2的证据。项目有望揭示足细胞脂筏蛋白Flot2的调控机制，发现Klf15参与足细胞损伤修复的新机制，为慢性肾脏病的防治提供新靶点及理论依据。

足细胞损伤是出现蛋白尿的重要原因，也是多种慢性肾脏病的共同发病机制。脂筏在维持肾小球足细胞正常的结构和功能中发挥着重要的作用。Flot2是重要的脂筏蛋白，但其在肾小球足细胞损伤中的作用及机制仍不清楚。项目以肾小球足细胞为研究对象，首次通过体内外实验发现脂筏蛋白Flot2在足细胞损伤中的作用及其可能机制，并探讨了其上游的调控机制。研究发现：（1）在肾小球疾病患者的足细胞中Flot2表达明显下降，在体外培养的足细胞中给予损伤刺激，Flot2的表达也显著减少。（2）在LPS/ADR的诱导的肾病小鼠模型中，足细胞特异性敲除Flot2导致更严重的蛋白尿、足细胞损伤和肾小球病理改变。（3）与之相反，足细胞特异性Flot2过表达转基因小鼠在LPS或ADR刺激下可防止足细胞损伤、蛋白尿和病理异常；（4）在体外和体内分别使用siRNA和足细胞特异性的Flot-2敲除降低Flot-2的表达会导致细胞骨架破坏和裂孔隔膜蛋白(podocin, nephrin和CD2AP)在脂筏中的定位减少；与之相反，在体外和体内足细胞中过表达Flot-2可减弱细胞骨架破坏并抵消脂筏中裂孔隔膜相关蛋白的减少。（5）我们进一步研究表明Flot2和podocin通过它们的SPFH域直接相互作用，Flot2通过与podocin直接结合，稳定其在脂筏中的定位。（6）此外，我们还发现转录因子KLF15在足细胞损伤相关肾小球疾病中表达明显下降，并且KLF15对Flot2具有直接对转录调控。（7）最后，我们发现肾小球Flot2的表达量与患者24h尿蛋白呈负相关，与eGFR呈正相关。项目的研究结果提示Flot2可能是治疗足细胞损伤相关蛋白尿肾病的一个潜在靶点。