长牡蛎吞噬细胞鉴定及吞噬作用机制研究

Innate immunity is the key component of pathogen resistance in marine invertebrates. As the significant part of innate immunity, phagocytes play pivotal roles in pathogen recognition, phagocytosis and clearance. This project will focus on the study of phagocytes from the marine invertebrate Crassostrea gigas. Fluorescence activated cell sorting of phagocytes combined with whole cell proteome study will be performed to screen pattern recognition receptors and signaling proteins with high accuracy and high throughput. Moreover, molecular cloning and prokaryotic expression of proteins will be applied to the study on pathogen recognition as well as signal transduction. Furthermore, immune activities comparision after phagocytosis will facilitate the illumination of phagocytes in innate immune response and immune modulation. In summary, the study on the phagocytes and phagocytosis will be conducive to understanding the mechanisms of pathogen recognition, phagocytosis and clearance, deepening the cognition on the innate immune defense in marine invertebrates, as well as extending the immunology boundary of marine invertebrate animals.

海洋无脊椎动物主要依赖固有免疫抵御病原微生物的侵染，吞噬细胞作为固有免疫的重要组成部分，在病原物识别、吞噬和清除过程中发挥了关键作用。本研究项目以长牡蛎吞噬细胞为研究对象，采用流式细胞术结合蛋白质组学的研究方法，高通量筛选吞噬作用相关的模式识别受体和信号转导通路蛋白；采用分子克隆及蛋白重组表达等方法，获得吞噬作用相关蛋白，明确蛋白在病原识别和信号转导中的作用机制；采用细胞免疫学方法，比较吞噬细胞在吞噬过程中的免疫活性差异。通过对长牡蛎吞噬细胞和吞噬作用机制的研究，明确吞噬细胞识别、吞噬和清除病原物的机制，揭示吞噬细胞在牡蛎固有免疫应答及免疫调控中的作用，深化对海洋无脊椎动物固有免疫防御机制的认识，丰富和发展海洋无脊椎动物免疫学内容。

本研究以长牡蛎为研究对象，分析吞噬细胞的形态和功能特征，筛选吞噬细胞差异表达蛋白，鉴定多种吞噬相关免疫识别受体。研究进展如下：.一、吞噬细胞分离、鉴定及分子特征。（1）流式细胞术分析显示，长牡蛎血淋巴细胞分为粒细胞，半粒细胞和脱粒细胞三种类型。粒细胞和半粒细胞具有吞噬能力，脱粒细胞不具有吞噬能力。采用整合素抑制剂和多种糖基处理能够显著抑制血淋巴细胞对病原菌的吞噬作用。LPS刺激能够显著提高血淋巴细胞对病原菌的吞噬能力。（2）流式细胞术分选吞噬细胞与非吞噬细胞，细胞组化染色显示吞噬细胞的细胞组分特征；扫描电镜结合透射电镜揭示吞噬细胞的超微结构特征；流式细胞术揭示吞噬细胞的免疫分子特征。(3)同位素标记的相对和绝对定量分析获得吞噬细胞上调蛋白358个，下调蛋白207个。生物信息学分析显示，吞噬细胞上调蛋白主要集中于氧化还原反应和溶酶体相关的蛋白质降解途径等。胞内染色结合流式细胞术检测显示组织蛋白酶在吞噬细胞中高表达。.二、免疫受体对细胞吞噬的调控作用。（1）分离甘露糖高亲和力DM9结构域包含蛋白。糖芯片分析该蛋白的识别受体为甘露糖相关糖基，并精准测定其与甘露糖相互作用的热力学常数。通过解析该蛋白、蛋白与甘露糖复合物及功能丧失型突变体的晶体结构，分析其与配体相互作用的分子机制。该蛋白具有广谱的微生物识别能力，能够介导血淋巴细胞对多种微生物的细胞吞噬作用。（2）鉴定了具有较高脂多糖结合活性的C1q结构域包含蛋白，该蛋白与脂多糖结合的解离常数为0.09×10-6 M。灭活灿烂弧菌刺激能够上调其mRNA表达水平，重组蛋白刺激能够促进血淋巴细胞对灿烂弧菌和大肠杆菌的吞噬作用。 (3) 鉴定血淋巴中的精氨酸激酶能够结合脂多糖，其与脂多糖结合能显著抑制其ATP水解酶活性，导致胞外ATP的累积，进而刺激血淋巴细胞内Ca2+释放、活性氧生成和溶酶体水平降低。精氨酸激酶通过调节胞外ATP水平，诱导血淋巴细胞产生活性氧依赖的杀菌活性。