海洋源性NA和NF-κB双靶向抗流感新型先导化合物研究

Neuraminidase is the key enzyme for influenza virus evolution. Neuraminidase inhibitors are regarded as the unique effective anti-influenza drug. However, the report for the oseltamivir resistance H1N1 and H5N1 strains increased. NF-κB is extremely important for replication of influenza viruse, what's more, influenza virus can't alter the function of this cytokine by gene mutation. Therefore, the influenza virus can't emerge drug resistance easily for the drugs targeted this cytokine, which provide a new strategy for influenza drugs. The research team has initiated new NA and NF-κB inhibitor selective system based on the neoteric structural pattern metabolic products of the South China Sea microbe aimed NA and NF-κB. A series of targeted compound were obtained by high though out selective of computer-assisted drug targeted fictitious triage techniques. The phenetole compound VD6 was observed extremely anti-influenza virus activity. We will carry out research about the interaction between VD3 and NA or NF-κB, the antivirus activity of VD3 and signal transduction passageway. The aim of this project is to develop new NA and NF-κB two-sided target influenza inhibitor and provide new strategy for influenza treatment.

神经氨酸酶（NA）是流感病毒进化过程中的关键酶，NA抑制剂是目前认为唯一有效的抗流感药物。但H1N1和H5N1 oseltamivir抗药株的报道日益增多。NF-κB对流感病毒的复制至关重要，病毒不能轻易地通过基因突变改变此细胞因子的功能，以该细胞因子做为抗病毒靶点，不会产生抗药性，提供了一种新的流感药物设计策略。本申请者前期研究以NA和NF-κB为靶标，并基于结构模式新颖的南海微生物代谢产物库，首创性构建了新型NA和NF-κB抑制剂筛选体系，结合计算机辅助药靶虚拟筛选技术开展了高通量筛选，获得了一系列目标化合物，并发现其中的异苯乙醚化合物VD6具有极强的体外抗流感活性。本课题拟将重点围绕VD6与NA和NF-κB的相互作用关系及其抗病毒活性和信号转导通路展开研究。本项目致力于研究发现国内外首创的新的病毒NA和宿主NF-κB双靶向流感抑制剂，为靶向性抗流感治疗增添新的力量和思路。

神经氨酸酶（NA）是流感病毒进化过程中的关键酶，NA抑制剂主要通过与 NA 中的保守序列结合使NA 失活，使病毒的出芽、 扩散受阻，感染被局限，是目前认为有效的抗流感药物。流感病毒是少数几个在细胞核内复制基因组的RNA病毒，因此，可以依赖宿主细胞核转运机制进行增殖。很多细胞因子是病原体完成生活周期所必须的，而 NF-кB是一种重要的病原体激活的细胞信号因子，NF-кB激活会引起大量抗病毒基因上调，因此被认为是一种重要的机体固有免疫防御调节因子。可见NF-кB对流感病毒的复制至关重要，同时病毒不能轻易地通过基因突变改变此细胞因子的功能，因此以该细胞因子为药物靶点，病毒不会轻易产生抗药性。本研究以NA 和 NF-κB 为靶标，构建了新型NA 和NF-κB抑制剂筛选体系，结合计算机辅助药靶虚拟筛选技术开展了高通量筛选，获得了一系列目标化合物。本课题围绕目标化合物与NA和NF-κB的相互作用关系及其抗病毒活性和信号转导通路展开研究，探讨化合物抗流感效果及可能机制。分别用实时荧光定量PCR方法、红细胞凝集实验、免疫荧光染色技术和Western blotting检测化合物处理流感病毒和细胞后，细胞内的病毒量和病毒蛋白的表达情况，检验目标化合物在体外细胞水平上抑制流感病毒的复制效果。同时测定目标化合物处理流感病毒和细胞后细胞的存活率，检验目标化合物在细胞水平上对受流感病毒感染的细胞保护效果。并测定目标化合物处理流感病毒和细胞后，病毒NA蛋白 mRNA水平的变化和NA蛋白的表达变化及活性，验证目标化合物是通过抑制流感病毒NA蛋白起到抗病毒作用。采用NF-κB活性荧光素酶报告系统，检测到目标化合物处理细胞后NF-κB转录活性情况，验证目标化合物是否抑制NF-κB信号通路起到抗病毒作用。采用蛋白核浆分离技术，对目标化合物处理后的细胞分别提取胞浆和胞核的蛋白，分别检测流感病毒蛋白NP，验证子代病毒的出核是否受到抑制。检测NF-kB下游直接调控的基因，验证目标化合物是否抑制NF-κB下游直接调控的基因的表达。了解化合物与靶位点NA以及宿主NF-κB信号通路的直接作用关系，系统性体内体外抗流感活性能力，为开发新型抗病毒候选药物奠定了基础。同时研究了H7N9禽流感病毒的分子变异和流行情况，了解目标化合物对新型人禽流感病毒的可能效果。发表带该基金号文章共5篇，其中SCI论文3篇，核心期刊2篇。