番茄LeMPK1应答高温胁迫的功能及作用机理研究

促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联系统是植物细胞将胞外逆境信号转换成胞内反应的主要途径之一。我们已有的实验数据表明，高温活化的LeMPK1参与番茄耐高温诱导的氧化伤害，推测LeMPK1在番茄耐高温胁迫过程中发挥重要作用，但其响应高温胁迫的生物学功能和生理机制还不清楚。本项目试图克隆LeMPK1全长cDNA，构建基因过表达和沉默载体，用农杆菌介导的叶盘法导入番茄植株；通过gain-of-function和loss-of-function评估番茄叶片中高温活化的LeMPK1与热击蛋白表达、抗氧化损伤、光合作用及番茄耐热性的关系；通过蛋白质组学方法分析番茄突变体材料，寻找高温胁迫下LeMPK1介导的下游组分，构建蛋白调控网络。这一研究对于探明番茄在高温胁迫信号转导调控机理方面具有重要意义，也为利用基因工程手段提高番茄耐热品种的选育和完善番茄耐热型栽培技术提供理论依据。

高温是植物生长过程中常见的逆境胁迫因子。植物遭受高温胁迫的过程，是活细胞感应、传递高温信号，并通过改变其细胞生理代谢、启动各种防护机制以维持其生命活动的过程。促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）是植物细胞将胞外刺激信号转换成胞内反应的重要组分之一。近年来，在植物中发现了大量的MAPKs，其相关功能研究也较为深入，尤其是应答干旱、盐害和低温的作用机制方面。然而，植物MAPK与耐热性关系的研究很少报道且机理未知。在本项目的资助下，我们初步研究了番茄LeMPK1应答高温胁迫的功能及作用机理。.1. 构建LeMPK1过量表达（OE）和沉默/RNA干扰（RNAi）载体，采用农杆菌介导的叶盘法转化番茄，成功获得了转基因株系（LeMPK1-OE有2个株系；LeMPK1-RNAi有10个株系），并通过转基因植株研究了高温胁迫下LeMPK1的功能及与耐热性的关系。.2. 高温胁迫下，RNAi植株能够应答高温信号，存活率高、抑制程度明显低于野生型，具有明显的耐高温表型；而OE株系耐高温能力下降。结果表明，LeMPK1应答高温胁迫信号存在负调控机制。.3. 生理生化分析显示，高温胁迫下RNAi植株比野生型番茄细胞内活性氧（ROS）积累量少，明显提高了抗氧化防护酶（SOD、POD、CAT、APX和GR）活性和相关抗氧化酶相关基因的表达；而OE植株的ROS积累量增加，PSII原初光能转化效率(Fv/Fm)降低较快。结果表明，LeMPK1应答高温信号与氧化胁迫伤害有关。.4. 通过转录组表达测序分析高温胁迫下OE材料，结果显示OE植株中大量刺激应答基因发生下调。通过蛋白质组学方法（iTRAQ）分析RNAi突变体材料，寻找LeMPK1下游的蛋白组分，鉴定到30个高温胁迫下LeMPK1介导的差异蛋白。GO生物学功能分析表明，其中11个蛋白与氧化还原代谢有关。结果表明，LeMPK1通过介导氧化还原蛋白网络调控番茄的耐高温性。.5. 该研究结果表明，LeMPK1应答高温信号存在负调控机制，并且这种应答机制与LeMPK1介导的抗氧化系统防护及氧化还原代谢有关。这一研究结果有利于我们对植物响应高温胁迫并调控生理耐热适应性的分子基础和作用机制的进一步理解。