牛磺酸转运体对颅脑创伤大鼠脑线粒体质量控制的作用研究

How to reduce disability and death following traumatic brain injury (TBI) is focused on preventing secondary insults cascades that including edema, ischemia, excitotoxicity, inflammation, oxidative damage, and activation of necrotic and apoptotic cell death signaling events. The quality control of brain mitochondrial State has played a key role in this process and close relationship with the function recovery after TBI. The previous studies by our research group, carried out with the support of the national Science Foundation (30973089), suggest that the exogenous taurine by taurine transporter (TAUT) has the very good protection effect on brain edema, energy metabolism and mitochondrial function in rats with severe TBI. To further demonstrate assumption that the functional deficit of TAUT in the membrane of cell or mitochondrial is one of the major mechanisms with secondary injury in TBI rats, in this project, we will explore the brain protein changes of mitochondrial quality control in TBI rats by building a conditional TAUT gene knock-out model in the central nervous system of rats and transgenic TAUT rat model. From the perspective of mitochondrial quality control, the therapeutic and mitochondrial mechanism of taurine via TAUT to injuried brain tissue and mitochondria will be proved and it is also offered a theoretical base for treatment of taurine to severe TBI in clinic.

如何防止颅脑创伤（TBI）后的继发性损害一直是TBI研究的主要方向，脑内线粒体的质量控制状态在继发性损害中起着关键性作用，并与TBI后功能恢复有着密切关系。前期国家基金支持下我们发现外源性牛磺酸通过牛磺酸转运体（TAUT)对重型颅脑创伤大鼠脑细胞水肿、能量代谢和线粒体功能等具有很好的保护作用。为进一步验证 "细胞膜和线粒体膜上TAUT受损是颅脑创伤继发性损伤的重要发病机制" 的假设，本课题中我们拟通过构建中枢神经系统特异性基因敲除TAUT、过表达TAUT的TBI大鼠模型，以脑皮层和海马为主要对象，探索TBI大鼠脑线粒体质量控制的蛋白变化，验证牛磺酸是否通过TAUT对脑细胞线粒体质量控制途径产生治疗作用，进一步阐明其线粒体作用机制和神经保护作用，从线粒体质量控制这一崭新角度寻找新的治疗靶标蛋白，为外源性牛磺酸用于TBI的临床治疗提供理论依据。

本课题的研究内容有：(1)成功构建了脑特异性表达TauT转基因模型大鼠（KI大鼠）；利用CRISPR/Cas9技术，针对Slc6a6基因第5外显子，成功构建了TAUT全身敲除大鼠（KO大鼠）和中枢神经系统TAUT 基因敲除大鼠模型（CKO大鼠），对这3种基因模型进行繁殖和鉴定，发现KO/CKO大鼠生育力较差，发育较慢，抗打击力差；（2）观察3种基因模型的脑核磁波谱、学习记忆、一般生理生化特性、超微结构、线粒体膜电位、呼吸功能、复合物酶蛋白等变化，发现KI\KO\CKO大鼠与正常大鼠（WT大鼠）的脑核磁波谱、学习记忆、一般生理生化特性、线粒体膜电位、线粒体呼吸功能RCR和P/O等均无影响，对体重、脏器、血项等生理代谢指标无显著改变；KO\CKO大鼠出现线粒体自噬情况，脑组织线粒体呼吸链酶复合体Ⅲ、Ⅴ活性显著降低， 表明TAUT的转入不影响大鼠线粒体的功能，而TAUT敲除影响大鼠大脑组织线粒体的酶活性。(3) TBI后，KI大鼠可以上调脑线粒体呼吸功能（RCR）、呼吸链复合物活性；KO\CKO大鼠对TBI后这些指标无调节作用，说明TAUT对TBI大鼠大脑线粒体功能恢复具有部分保护作用（4）TAUT的敲除影响线粒体的PGC-1α、NRF-1、TFAM基因表达，从而影响线粒体氧化代谢功能；TAUT可以适当通过增强TBI大鼠大脑PGC-1α的表达，继而上调PGC-1α的下游因子NRF-1、TFAM的表达，改善线粒体功能和修复损伤，对脑组织具有保护作用。（5）TBI后线粒体分裂融合蛋白Drp1和自噬蛋白LC3II、PINK1显著上升，PINK/Parkin介导TBI后脑组织线粒体的激活；TBI-KI大鼠明显抑制凋亡的发生，并降低线粒体融合蛋白Drp1和自噬蛋白水平；表明TAUT可以调控TBI后的线粒体自噬。（6）初步研究了KO大鼠脑线粒体蛋白组学的变化，发现KO大鼠线粒体蛋白上调350个，下调530个，激活Akt1、Mapk8、Stat3、Myc等蛋白信号通路，抑制了线粒体一些重要的蛋白酶如Cpt类、Ech1、Creb1、Acsl1、Hmgcl、Acsl5、Decr1，可能会引起大鼠大脑炎性因子的上调和代谢方面的紊乱，从而损伤大脑。通过以上实验，初步验证了我们的假设“细胞膜 TAUT 功能受损对TBI继发性损伤具有一定的调节作用”