长链非编码RNA MIPs在小孢子分化发育过程中的功能研究

In flowering plants, pollen develops by a special postmeiotic process. The microspore (MS) resulted from meiosis gives rise to the larger vegetative cell (VC) and the smaller generative cell (GC) embedded in VC via asymmetric division. GC further mitotically divides to produce two SCs in VC which is terminally differentiated. Asymmetric division is determinative and immediately confers the differential identity and fate of the two daughter cells. Thus, the fate establishment and cell commitment of MS are key in this process. Using isolated MS, GC and SC, we find that MS expresses marker genes of stem cells and repression of the marker genes occurs following asymmetric division, indicating the transcriptional repression switch should be associated with MS commitment and GC identity. lncRNAs displayed greater cell/tissue-type specificity than mRNAs. We have obtained top 9 lncRNAs at expression levels (termed MIPs--microspore-preferential) from the lncRNAs preferentially expressed in MS. Based on these data, this project will focus on (1) dissection of MIP localization in cytoplasm and cell nucleus of MS, (2) cytological study of MS and its daughter cells in mip mutants, (3) analysis of expression levels of stem cell maker genes and genes around MIP locus in mip mutant and (4) proteomic dissection of proteins interacted with MIPs. Finally, we will reveal function of MIPs in MS differentiation and development and the underlying mechanisms, thus supplying novel mechanistic insights into the molecular network of pollen development.

花粉有独特的发育模式，即小孢子之后的生殖细胞和精细胞发育是在营养细胞内完成的。花粉发育的核心问题是如何有序地调节不同阶段细胞的命运和定向发育、以建立这种独特的发育模式，其中小孢子的命运决定和定向发育是关键环节。我们利用分离的小孢子、生殖细胞和精细胞发现小孢子表达干细胞标记基因，这些基因表达的抑制是小孢子定向发育成生殖细胞和随后的精细胞的重要分子标签，lncRNAs比mRNAs有更高的细胞特异性；通过比较不同细胞和组织的lncRNAs表达谱，揭示了小孢子优势表达的lncRNAs，从中筛选了9个表达水平最高的，即MIP（microspore-preferential）。本项目以MIPs为切入点，通过（1）亚细胞定位分析，（2）突变体小孢子及其子细胞的细胞学解析，（3）干细胞标记基因以及MIP基因座邻近基因在突变体小孢子的表达特征解析和（4）互作蛋白解析，揭示了MIPs在小孢子分化发育中的功能及及其作用机制。

花粉有独特的发育模式，即小孢子之后的生殖细胞和精细胞发育是在营养细胞内完成的。花粉发育的核心问题是如何有序地调控不同阶段细胞的命运和定向发育、以建立这种独特的发育模式，其中小孢子的命运决定和定向发育是关键环节。本项目以14个前期RNA-seq检测的小孢子优势表达lnRNA基因为候选，利用CRISPR技术，获得了13基因的基因编辑突变体，其中一个基因的片段敲除突变体因小孢子死亡导致花粉完全败育，因此将该基因命名为CELL DEATH 1(CED1)。为了确定这个基因的转录本，我们进行了RACE实验，发现CED1产生两种转录本，这个较长的是前期预测的lnRNA （称为CED1n），而较短的是mRNA（称为CED1）。 遗传互补实验证明CED1能回补突变体小孢子败育表型，因此我们重点研究了CED1调控小孢子发育的机制。证明CED1在小孢子母细胞、四分体和小孢子中优势表达，相对于CED1n，CED1有较高的表达水平；CED1蛋白有一个跨膜结构域、具有内质网与质膜定位特性；ced1突变体小孢子有PCD的细胞学特征，包括细胞质皱缩、细胞核凝集、有TUNEL信号、异常表达dPCD标记基因；突变体四分体与早期小孢子产生较多的、体积偏大的液泡，晚期小孢子缺乏中央大液泡，液泡也不能被中性红染色，表明突变体液泡发生和pH稳态异常。通过膜体系酵母双杂交筛选和Co-IP验证，获得了3个CED1互作蛋白，这三个互作蛋白均是液泡型质子ATP酶复合体（V-ATPase）的亚基组分。综上所述，CED1是一个重要的小孢子命运决定因子，其可能通过与V-ATPase亚基组分互作影响小孢子液泡的发生与pH稳态，进而调控小孢子的命运与发育。因此，该项目为小孢子命运决定和发育的研究提供了新的分子标记，为深入理解小孢子命运决定和发育的调控机制与分子网络提供了新知识。