线粒体自噬与凋亡平衡在脓毒症心肌病中的作用和分子机理研究

Sepsis often complicated by heart suppressed/dysfunction and influence patients' prognosis. The relationship between the mitochondrial autophagy and apoptosis in septic cardiomyopathy is closely related. Our previous study found that mitochondrial UCP2 could improve LPS-induced myocardial injury in dogs; and the myocardial cytochrome c oxidase activity of septic cardiomyopathy CLP rats by melatonin pretreatment was significantly altered, lactate levels reduced, which improving heart function and prognosis. However, the molecular mechanism remains to be further explored. This study intends to prepared LPS induced UCP2 knockout mouse model in order to prove ROS production, energy metabolism, mitochondrial membrane potential, and other aspects, which will lead to myocardial mitochondrial autophagy/apoptosis imbalance. Meanwhile, melatonin intervention was performed in LPS-induced septic cardiomyopathy mice to demonstrate the molecular mechanism of the UCP2-mediated mitochondrial autophagy pathway/apoptosis, which play a role in affecting heart function. In addition, H9C2 cell was used in vitro and sepsis patients were selected from clinic to further verify the above process, reveal the molecular mechanisms of melatonin on cardiac function improvement. This study may provide a new insight into the mechanism of mitochondrial autophagy/apoptosis and septic cardiomyopathy.

脓毒症时往往会早期伴发心功能不全/抑制且影响患者预后。线粒体自噬和凋亡与脓毒性心肌病具有密切关系。我们前期研究发现线粒体UCP2可以改善LPS诱导犬心肌损伤，而经melatonin预处理CLP脓毒症心肌病大鼠，则显著改变大鼠心肌细胞色素c氧化酶的活性、降低血乳酸水平，改善的心功能和预后，但分子机理尚有待进一步探讨。本项目拟制备LPS诱导的UCP2基因敲除小鼠模型，证明ROS的产生、能量代谢、线粒体膜电位等方面的改变会导致心肌线粒体自噬/凋亡的失衡。同时以melatonin干预LPS诱导的脓毒症心肌病小鼠并证明其对于UCP2介导的线粒体自噬/凋亡的途径发挥作用而影响心脏功能的分子机理。另外，通过体外细胞实验和临床脓毒症患者为研究对象进一步验证上述过程，说明melatonin对心脏功能的改善作用和相关机制。通过本研究的开展为线粒体自噬/凋亡和脓毒症心肌病发生机制提供新的认识。

背景：脓毒症是重症医学最常见和最严重的疾病之一，其高发率和高死亡率引起了强烈的关注。此外，脓毒症引起的多器官功能障碍增加其治疗难度，众多研究已证明出现心功能异常/损伤的患者预后更差。因此，为寻找有效的治疗靶点，脓毒症相关的机制研究具有重要意义。解耦联蛋白（uncoupling protein 2，UCP2）为线粒体内膜上的阳离子载体蛋白，可引起质子渗漏，使线粒体膜电位降低，氧化磷酸化过程解偶联。UCP2上调可以减少ROS生成、预防线粒体Ca2+超载。既往研究提示UCP2在脓毒症心肌损伤时有保护作用，但具体机制不明。本项目研究脓毒症心肌病时UCP2平衡心肌细胞凋亡和自噬的机制，并探讨褪黑素可能的治疗作用。研究内容：本项目主要研究了LPS诱导的脓毒症小鼠、UCP2基因敲除小鼠脓毒症模型心肌ROS产生、能量代谢、线粒体膜电位、心肌细胞自噬/凋亡的改变；同时也探究了褪黑素干预 LPS 诱导的脓毒症小鼠和 UCP2 基因敲除小鼠脓毒症模型后心肌细胞自噬/凋亡的改变；同时通过体外细胞实验，研究了UCP2在LPS诱导心肌细胞株AC16的作用，包括使用siRNA干扰和质粒转染技术沉默或增强 UCP2 的表达，并使用褪黑素进行干预，检测心肌细胞 ROS 水平、线粒体膜电位、线粒体能量代谢与自噬/ 凋亡相关分子的改变。 结果：增加UCP2的表达可以改善脓毒症心肌病时心肌细胞线粒体的功能，减轻心肌细胞的损伤，而UCP2基因敲除可使脓毒症心肌线粒体损伤程度加重，导致心肌不可逆损伤，UCP2是脓毒症心肌保护的关键蛋白；经过LPS干预后AC16心肌细胞活性下降，线粒体损伤，包括：线粒体膜电位下降，线粒体渗透性转移孔的大量开放，钙离子明显超载，ROS生成增多，最终引起ATP合成减少，能量合成和代谢障碍。使用褪黑素可增加UCP2的表达，并减少细胞及线粒体损伤程度。UCP2表达增多可引起自噬蛋白Beclin-1和LC-3β的增加，凋亡蛋白细胞色素C和caspase-3的减少。科学意义：UCP2可通过调节心肌细胞凋亡和自噬的平衡改善心功能和心肌细胞活性，增加UCP2的表达是改善心肌功能的治疗新靶点，褪黑素可通过调节UCP2起到保护心肌细胞的作用。