豌豆根瘤菌过氧化物还原酶在共生固氮中的作用及调控机制

Rhizobia are rhizospheric soil bacteria, can interact symbiotically with legumes to form nitrogen-fixing nodules. Peroxiredoxins (Prxs) reduces peroxides with redox-active cysteine, play an important role in symbiotic nitrogen fixation. Rhizobium leguminosarum bv. viciae 3841 genome contains three peroxiredoxin-encoding genes. In this study, mutations in one, two or all three prx genes will be constructed by homologous recombination and transduction. In order to investigate the function of peroxiredoxins in symbiotic nitrogen fixation, a series of experiments such as symbiotic phenotype, prxs relative gene expression, temporal and spatial expression of Prxs, analysis of key substrates and enzymes will be conducted to test the differences of nodules infected by wild type and prx mutants. To further determine the regulatory mechanism of peroxiredoxins on nodule redox system, the technique of two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2-D DIGE) for differential protein expression analysis will be evaluated using R. leguminosarum 3841 prx triple mutant infected pea nodule bacteroids. Real-time quantitative RT-PCR, Western blotting and gene mutation will be conducted to determine the interaction mechanism between the target proteins and Prxs.

根瘤菌为根际土壤细菌，与豆科植物共生形成固氮根瘤。过氧化物还原酶(Prxs)依靠自身的半胱氨酸进行氧化还原反应，能有效地清除活性氧，在根瘤菌-豆科宿主共生中发挥重要作用，但其作用机制未得到阐明。豌豆根瘤菌3841基因组含有3个过氧化物还原酶编码基因。本项目拟通过基因同源重组和转导技术，构建过氧化物还原酶单、双和三（全）基因突变株。进一步通过突变株和野生株感染豌豆宿主，比较它们在共生表型、prxs相关基因表达、Prxs的时空表达特征、关键作用底物及酶活性等方面的差异，系统研究豌豆根瘤菌过氧化物还原酶在共生固氮中的功能。在此基础上，通过荧光差异双向凝胶电泳（2-D DIGE）筛选过氧化物还原酶全基因突变株形成根瘤类菌体中的差异蛋白质，并利用实时定量RT-PCR、Western blotting以及基因突变技术对差异蛋白质的功能进行确证，研究过氧化物还原酶在根瘤氧化还原体系中的调控机制。

根瘤菌与豆科植物共生，在根瘤中形成具有固氮能力的类菌体。过氧化物还原酶是典型的硫氧还蛋白家族氧化还原酶类，通过清除过氧化物，保护细胞免受氧化物侵害，在共生固氮体系中发挥重要作用。豌豆根瘤菌3841基因组含有3个过氧化物还原酶编码基因。项目通过基因同源重组和转导技术，构建了过氧化物还原酶单、双和三（全）基因突变株。在以葡萄糖为唯一碳源的AMS基本培养基中，所有prx突变体的生长与野生型无显著差异，而三突变体RLprxABC对SDS、H2O2、CuOOH以及结晶紫的敏感性显著高于野生型RL3841。与野生型菌株相比，prxC突变株早期结瘤数显著增加，而三突变体RLprxABC的早期结瘤数则显著减低。prxC基因缺失和prx三基因缺失对根瘤菌在根际的定殖和竞争能力有严重的影响。在共生实验中，尽管过氧化物还原酶单、双和三（全）基因突变株都可形成固氮根瘤，但是RLprxA、RLprxB和RLprxABC接种植株的固氮酶活显著低于野生型RL3841。将4周的根瘤进行石蜡切片及电镜超薄切片，发现突变体RLprxABC形成小根瘤，根瘤含类菌体细胞数明显减少，并出现部分类菌体自溶，表明prx基因在根瘤类菌体分化和防止根瘤过早衰亡中发挥重要作用。荧光定量PCR检测不同条件下prx基因的表达量。结果表明，在H2O2胁迫下所有prx基因表达并没有受影响。prxA基因在根瘤生长早期、中期和晚期表达量显著增高，而prxB和prxC基因在根瘤中的表达无显著差异。prxA和prxB基因在豌豆根圈中显著表达，并且prxB基因的表达量在厌氧环境下显著增高。蛋白组学研究表明：与野生型RL3841相比，突变体RLprxABC接种根瘤类菌体中有50个蛋白显著上调，25个蛋白显著下调。在这些差异蛋白中，有22个为转运活性相关蛋白，11个为应急反应和毒力相关蛋白，14参与氨基酸代谢、能量代谢和共生进程。表明豌豆根瘤菌过氧化物还原酶作为重要的抗氧化物参与根瘤共生。在项目执行期间，发表了高水平学术论文8篇，其中SCI收录6篇，Top期刊3篇。授权国家发明专利4项,培养了硕士研究生9名，其中毕业硕士5名。