PKC调节的IP3受体磷酸化在胆囊收缩素介导的胃Cajal间质细胞钙振荡中的作用

胆囊收缩素（CCK）在胃肠运动中起重要调节作用，Cajal间质细胞（ICC）作为胃肠运动的起搏细胞，可能通过激发胞内钙离子（Ca2+）振荡产生起搏电流，是胃肠道慢波电位形成的基础。本研究在前期预试验成功培养ICC基础上，拟探讨CCK作用下胃ICC胞内Ca2+变化对ICC起搏电流的影响及与蛋白激酶C（PKC）介导的三磷酸肌醇受体（IP3R）磷酸化信号通路的关系。首先分离培养ICC，免疫荧光技术检测ICC胞内Ca2+变化及其在ICC起搏电流中的作用，观察CCK对Ca2+振荡变化的影响，以及PKC调节的IP3R磷酸化在CCK介导的ICC胞内钙释放对Ca2+振荡的影响；细胞膜片钳技术检测CCK作用下ICC表面电压依赖型钙通道电流在ICC胞内Ca2+振荡中的作用；免疫荧光双标技术检测CCK作用下ICC胞内PKC调节的IP3R磷酸化水平，以期探讨PKC信号通路在CCK对胃ICC胞内Ca2+振荡的作用。

胆囊收缩素（CCK）在胃肠运动中起重要调节作用，Cajal间质细胞（ICCs）为胃肠运动的起搏细胞，可能通过激发胞内钙离子（Ca2+）振荡产生起搏电流，是胃肠道慢波电位形成的基础。本研究探讨了硫化八肽CCK（CCK-8S）作用下胃窦ICCs胞内Ca2+变化对ICCs起搏电流的影响及与蛋白激酶C（PKC）介导的三型1，4，5-三磷酸肌醇受体（InsP3R3）磷酸化信号通路的关系。首先我们成功分离和培养胃窦ICCs，Fura-3/AM负载ICCs检测了CCK-8S、CCK受体拮抗剂氯戊米特、内质网钙泵拮抗剂毒胡萝卜素、InsP3R3拮抗剂xestospongin C及Ca2+通道阻滞剂硝苯地平对ICCs胞内钙振荡的影响。免疫荧光双标技术检测CCK-8S作用下ICCs胞内PKC调节的InsP3R3磷酸化，探讨了该通路在ICCs胞内Ca2+振荡中的作用。采用细胞膜片钳和离体肌条实验观察CCK-8S等作用下ICCs表面超极化激活的环核苷酸门控（HCN）通道在ICCs胞内Ca2+振荡及胃窦离体肌条收缩中的作用。结果示：1）采用混合酶法分离ICCs，培养1天后ICCs可贴壁生长，3天后ICCs间可相互连成网状，5-11天后网络明显形成；2）Fura-3/AM负载ICCs后观察，CCK-8S可显著升高ICCs胞内Ca2+，但分别可被氯戊米特、毒胡萝卜素、xestospongin C及PKC激动剂PMA显著抑制，去除细胞外Ca2+或给予硝苯地平可减弱CCK-8S的作用；PKC抑制剂Chelerythrine则增强该效应；3）CCK-8S上调ICC的InsP3R3磷酸化水平，chelerythrine可抑制该效应；4）CCK-8S显著增强胃窦平滑肌条的收缩，HCN通道抑制剂ZD7288 和CsCl可抑制该效应；5）细胞膜片钳可记录到ICCs表面的HCN电流，CCK-8S可显著增强该电流；去除胞外Ca2+，CCK-8S对HCN电流无明显作用。综合上述，CCK-8S通过作用于ICCs表面上CCK1受体促进其内质网上InsP3R介导的内钙释放，导致ICCs胞内Ca2+浓度显著升高，该作用受PKC介导的InsP3R磷酸化调节。HCN通道存在于ICCs上，且该电流在胃窦运动中起重要作用。CCK-8S可显著增强该电流，而胞外Ca2+在CCK-8S增强的ICCs的HCN通道的中起到的激活作用。