可溶性ZnT8表位/I-Ab二聚体诱导1型糖尿病抗原特异性自身免疫耐受的实验研究

Type 1 diabetes (T1DM) is one of the most serious autoimmune diseases threatening children and adolescence’s health. Damage of islet B cell mediated by T cells which are activated by antigen peptide/MHC molecule compound is the key pathogenesis. Zinc transporter 8 (ZnT8) is the key antigen caused autoimmune attack in patients with T1DM . As a new type of high-affinity T cell regulator, soluble pMHC dimmers(I-Ab) is expected to prevent autoimmune diseases by blocking autoimmune attack. Our previous work identified CD8 + T cell recognized epitopes of ZnT8 which can be used as T1DM specific immune tolerance antigen in T1DM . We propose that soluble Zinc transporter 8 epitope/I-Ab dimmers could induce specific immune tolerance of T1DM by combining and closing antigen-specific T cells. This study is planned to treat T1DM mice with this dimmer based on our previous work and theories of high affinity of I-Ab, specificity of ZnT8 and high immunogenicity of Epitope peptide, assess its efficacy, test its immune effects on islet B cell in vitro and in vivo, so as to provide a new method for the treatment of T1DM.

1型糖尿病（T1DM）是一种严重危害儿童和青少年健康的自身免疫性疾病，T细胞特异性识别抗原肽/MHC分子复合物（pMHC）后介导的胰岛B细胞损伤是其发病的关键环节。锌转运体8（ZnT8）是引起T1DM患者自身免疫攻击的核心抗原；作为一种高亲和力的新型T细胞调节剂——可溶性pMHC二聚体（I-Ab）可以通过阻断自身免疫攻击来治疗自身免疫性疾病。我们前期研究确定的CD8+T细胞识别ZnT8表位可以作为T1DM的特异性免疫耐受原。我们基于以上几点提出：ZnT8表位/I-Ab二聚体可能通过结合、封闭抗原特异性T细胞来诱导T1DM的免疫耐受。本项目拟在前期工作的基础上，利用I-Ab的高亲和力、ZnT8的特异性和表位肽的高免疫原性原理，采用基因克隆和融合蛋白技术合成该二聚体，评价其治疗T1DM小鼠的疗效，并于离体和在体T1DM小鼠模型上检测其对胰岛B细胞免疫应答的影响，为T1DM的治疗提供新思路。

1型糖尿病（T1DM）是种严重危害儿童和青少年健康的自身免疫性疾病，Z nT8表位/I-Ab二聚体可能通过结合、封闭抗原特异性T细胞来诱导T1DM的免疫耐受。本项目利用I-Ab的高亲和力、ZnT8的特异性和表位肽的高免疫原性原理，采用基因克隆和融合蛋白技术合成了该二聚体，评价了其治疗T1DM小鼠的疗效，并于离体和在体T1DM小鼠模型上验证了其对胰岛B细胞免疫应答的影响，可以在诱导抗原特异性免疫耐受的前提下，不影响机体正常的免疫应答即对其它抗原的反应，避免了系统性免疫耐受引起的继发肿瘤、感染等副作用，为T1DM的治疗提供新思路。研究结果显示：①细胞实验发现：经过7天的免疫，ZnT8/I-Ab二聚体可以在不影响细胞对其它非胰岛相关抗原免疫应答反应的前提下，显著的阻断ZnT8抗原特异性CD8+T细胞的增值，减轻ZnT8抗原特异性CD8+T细胞的细胞毒性反应，阻断ZnT8抗原特异性CD8+T细胞的细胞因子IFN-γ的释放；②在体实验发现：经过为期30周的干预治疗，跟对照组比较，ZnT8/I-Ab二聚体治疗能够显著降低1型糖尿病小鼠糖尿病的发生率（90% vs. 40%, P<0.05）,明显的减少小鼠胰腺组织炎性细胞的浸润和胰岛β细胞的破坏；③ZnT8/I-Ab二聚体作为针对1型糖尿病的特异性免疫耐受治疗手段，虽然在细胞和动物实验中展现了良好的效果和前景，但是对于1型糖尿病这种复杂的疾病来说，这种方法能否、何时在临床上推广还有很多问题需要研究；④课题组拓展了研究方案：A.鉴定了VitD结合蛋白HLA-A2限制性免疫原性肽的抗原决定簇（表位）（211-219和235-243肽段），发现这两个决定簇可以在体外能够激活自身反应性细胞毒性T淋巴细胞，在体内能够诱导NOD小鼠发生糖尿病。这丰富了1型糖尿病自身抗原家族成员，为1型糖尿病的干预措施研究提供了新的靶点。B.通过shRNA干扰沉默ZnT8基因，阻断1型糖尿病核心抗原ZnT8的表达，也可以阻断抗原特异性CD8+T细胞的增值，减轻其细胞毒性反应，阻断其炎性细胞因子IL-6、IL-1β的释放，减少小鼠胰腺组织炎性细胞的浸润和胰岛β细胞的破坏，阻止其血糖的升高。这说明shRNA干扰可能成为治疗1型糖尿病的一种方法。C.我们还对另外一种免疫细胞—2型糖尿病脂肪巨噬细胞的M1/M2极化的机制进行了研究，将免疫学研究进一步向2型糖尿病拓展