删除CD4+CD25+Treg协同A549-RNA-DC疫苗诱导抗肿瘤免疫应答作用的研究

在前期研究工作中，我们用人肺腺癌细胞株A549总RNA转染DCs构建了A549-RNA-DCs疫苗，体外试验证明其具有诱导肿瘤抗原特异性免疫反应的作用，且效应CTL有很强的杀伤肺腺癌细胞的功能。为了开发具有临床应用价值的肿瘤疫苗，本项目拟开展以下研究：1. 针对目前广泛应用的DC成熟诱导剂中含对DC成熟有抑制作用的PGE2和缺少Toll样受体信号刺激的缺陷，优化DC成熟诱导条件，诱导产生表型和功能成熟的DC（EDCs），以增强疫苗的免疫原性。2.构建A549-RNA-EDCs疫苗，通过体外试验和体内试验，研究其诱导肿瘤抗原特异性免疫应答的能力。3.针对CD4+CD25+Treg在肿瘤免疫耐受中的关键作用， 应用Ontak（美国FDA批准用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤的抗肿瘤药物）删除CD4+CD25+Treg，探讨A549-RNA-EDCs疫苗和Ontak联合治疗非小细胞肺癌的可行性。

在DC疫苗的研制中，目前广泛采用传统的“金标准”细胞因子鸡尾酒( TNF-α、IL-6、IL-1β 和 PGE2)诱导DCs成熟。然而，该方法因含有PGE2和缺少TLR信号刺激，不利于DCs合成IL-12。因此，其有效性具有争议。本项目对“金标准”细胞因子鸡尾酒进行改良，在诱导体系中加入TLRs 配基 polyI:C和CpG ODN来优化诱导DCs成熟条件，有效地增强了DC疫苗的抗肿瘤效应。主要内容和结果如下。1.用电穿孔法转染A549总RNA至未成熟DCs制备DC疫苗，分别用“金标准”鸡尾酒和改良鸡尾酒（IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2、polyI:C、CpG ODN）体外诱导DCs成熟。采用FACS、QRT-PCR和WB等方法测定相关分子表达，ELISA测定IL-12p70和IL-10的分泌。结果：改良组DCs表面高表达CD80、CD83、CD86、CXCR4、CCR7、CCL19、CCL21和 CXCL21；CCR5表达显著下调；CXCR4、CCL19、CCL21和CXCL21表达显著上调（P＜0.05）；IL-12p70分泌明显增高（P＜0.05）。2.分别用“金标准”鸡尾酒和改良鸡尾酒诱导转染过A549总RNA的DCs成熟，并与自体T细胞混合培养，诱导产生抗原特异性的CTL。采用MTT法测定细胞增殖指数，FACS鉴定T细胞表型，ELISA测定培养上清液IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5和IL-10的含量。结果：改良组T细胞增值指数、CD3+CD8+ T细胞比例和IFN-γ、TNF-α含量显著增高（P＜0.05）。3.建立A549荷瘤裸鼠模型，尾静脉注射CM-DiI标记的DCs，取肝脏、脾脏和瘤体制片，荧光显微镜观察DC的迁移。以改良组肝脏、脾脏和瘤体组织中的红色荧光标记细胞最多。4.采用多点注射法，将CTL注入瘤周。测量肿瘤体积，末次免疫7 d后，处死荷瘤裸鼠，称取瘤重，计算抑制率。免疫组化法和WB检测肿瘤组织COX-2、VEGF、Bcl-2和Bax的蛋白表达水平。结果：改良组CTL抑瘤率最大（69.62%）、Bax表达上调；COX-2、VEGF和Bcl-2表达下调。上述结果提示，改良鸡尾酒能诱导产生高成熟度的、具有较强迁移能力和抗肿瘤作用的DCs。