卵裂球时期单细胞活检对胚胎发育影响的研究

Pre-implantation genetic diagnosis has been widely adopted in clinical practice of assisted reproduction. In this technique, a cell is removed from the embryo blastomere for genetic analysis, a process with potential safety issues. In addition, whether the embryo cells has differentiated at the blastomere stage, how the remaining embryo compensates for loss of a cell, and some other key questions have not been answered. In this study, a single cell was removed from mouse or human embryo at the 4-cell or 8-cell stage, and the remaining embryo was cultured to blastocyst stage. Then using the single-cell transcriptome sequencing technique, transcriptome of the removed cell and the remaining embryo were sequenced, so as to investigate, from the perspective of gene expression, cell characteristics at the blastomere stage, the effect of removing a cell on transcriptome of the remaining embryo, and the compensating mechanism of the remaining embryo. Additional embryo will be used to confirm the result by Fluidigm gene expression assay. This study would clarify the effect of pre-implantation diagnosis on embryo, and help clarify the compensating mechanism of the remaining embryo, thus greatly promoting clinical practice of assisted reproduction and basic studies like embryo development and embryonic stemcell investigation.

辅助生殖技术中植入前遗传学诊断已经被临床广泛使用，该技术通常在胚胎卵裂球时期活检一个细胞用于遗传学检测，虽然现有证据表明PGD不会对辅助生殖结局造成明显影响，但其安全性目前尚无确定结论。另外，胚胎细胞在卵裂球时期是否已经存在特定分化，胚胎细胞损失后胚胎的补偿机制等问题目前研究也较少。本研究拟对人和小鼠胚胎4细胞、8细胞期时活检单个细胞，并将活检后的胚胎继续培养至囊胚期，采用单细胞转录组测序技术，对活检的单细胞及囊胚进行转录组测序，并采用单细胞定量PCR芯片技术对发现的关键基因在更多胚胎中进行验证。研究将揭示卵裂球时期胚胎细胞基因表达特性、获得取样后囊胚发育转录组学变化的规律，揭示胚胎损伤修复中的关键调控基因，这一研究从基因表达和调控的角度阐释单细胞活检对胚胎造成的影响，为植入前遗传学诊断的安全性问题提供基本数据；另外，胚胎损伤后的修复机制的阐明，也为胚胎干细胞等研究提供新的思路。

卵子的体外成熟(IVM)是生殖医学和动物育种的一项重要技术，然而，卵子细胞在体内和体外成熟的一致性仍是一个有争议的话题。目前并不能确认体外成熟的卵子完全达到体内成熟卵子的状态，同时体外成熟卵子的长期安全性也有疑问。在本研究中，我们收集了体内外成熟的MII期卵细胞以及GV期的卵细胞，同时提取DNA和RNA，进行转录组和DNA甲基化测序。结果表明，体内成熟的MII期卵细胞的总体基因表达水平明显低于GV期卵母细胞，整体DNA甲基化水平略高于GV期卵母细胞；而体外培养成熟的卵细胞与GV卵细胞相比没有明显的差异。同时，体内成熟的卵子上调和下调基因的数目明显多于体内成熟的卵子。对差异基因的GO功能聚类分析表明，体内成熟的MII卵细胞上调的差异基因功能主要集中于GTPase相关功能及转录调控因子相关功能，我们发现转录抑制因子Snai1、E2f4和Klf17明显上调，这3个转录抑制因子的上调可能是体内成熟的卵子与体外成熟卵子的主要差异。相关转录因子的上调可能是体内成熟MII卵子低基因表达水平的主要原因，同时，3个转录因子也参与了GTPase介导的相关通路，可能与卵子减数分裂的不对称性及卵子的细胞质成熟相关。而体内成熟的卵子中甲基化程度高，与GV期卵子相比，其基因的启动子区域呈现较多的DMRs区域，这表明体内成熟的卵子出项的甲基化升高与其基因表达水平低相关，但我们没有发现甲基化与基因表达有直接联系。因此，本研究认为，体内外成熟的卵子在基因表达及甲基化水平上并不一致，体内成熟的卵子表现出较高的甲基化水平和较低的基因表达水平，但基因表达与甲基化水平并不存在直接关系；转录因子 Snai1、E2f4和Klf17的高表达可能是体内成熟卵子出现较低基因表达的主要原因，同时这些转录因子可能通过调节GTPase相关通路对卵子的细胞质成熟进行调控。体外成熟的卵子缺乏这一调控机制，可能导致其后续发育存在一定问题，本研究使用昆明种小鼠进行实验，这一结果可能与昆明种小鼠的2-细胞阻滞特性相关，因此这一结论还需要进一步研究。