褐飞虱红色复眼的突变机理研究

As typical genetic marker, insect mutant eye color has significant research value and high potential for use. In our laboratory, a homozygous colony of red-eyed Nilaparvata lugens St?l (brown planthopper, BPH) was established. On the basis of previous genetic research, we will reveal the mutant mechanism of red eye color in BPH based on the comparison beween the wild-type and mutant-type colonies. First, locate the mutation step in xanthommatin biosynthesis/transport (metabolism step) by the mutant-type rescue experiment. Second, acquire xanthommatin-related genes in the metabolism step using the biological information and molecular biology technology, and ascertain the mutant gene and mutant fashion by sequence analaysis. Third, compare the differences in the mRNA level and the biochemical characteristics of recombinant protein of the mutation gene using real-time PCR and heterologous gene expression technology. Then, verify the mutant gene function by interruptting the wild-type eye color with RNAi technology. This study aim to reveal the biochemical basis and molecular mechanisms of red-eyed mutant in BPH. Using the mutant eye color gene as a visible genetic marker, it will not only improve the studies on functional genomics and proteomics in BPH, but also accelerate the studies of BPH biology traits related with red-eyed mutation.

昆虫变异眼色作为典型的遗传标记，具有重大的理论研究价值和很大的应用潜力。本项目组在前期成功选育褐飞虱红眼纯合品系和开展遗传学研究的基础上，拟以褐眼野生型和红眼突变型为研究对象，通过不同色素前体物添加对突变眼色的修复性试验明确红眼突变的生化基础，定位引起眼色突变的眼黄素合成/运输环节(代谢环节)；利用生物信息学和分子生物学技术，克隆代谢环节中的眼黄素相关基因，并在野生型和突变型中进行对比，确定突变基因和突变方式；利用mRNA定量技术和蛋白质体外表达技术，分析突变基因量变和所编码蛋白生化特性的改变；利用RNAi技术对野生型眼色的干扰性试验验证突变基因的功能。项目预期将揭示褐飞虱红眼突变的生化基础和分子机理。利用褐飞虱眼色突变基因作为遗传标记，不仅可以促进褐飞虱功能基因组学和蛋白质组学的研究，还可以促进与红眼突变相关的其他生物学性状的研究。

褐飞虱（Nilaparvata lugens）是水稻重要害虫，严重损害水稻的产量和质量。褐飞虱野生型个体复眼眼色为褐色，在长期饲养的室内品系中可见红色复眼突变体。红眼突变体作为可见遗传标记，具有多种应用价值。为了更好的利用此突变体，本项目进行了红眼突变分子机理的研究。前期的研究表明，红眼突变体的眼黄素仅为野生型个体的36.3%，受常染色隐形等位基因的调控。首先，本项目克隆了参与眼黄素合成和转运通路的6个基因的全长序列，分别编码色氨酸加氧酶、犬尿氨酸甲酰胺酶、犬尿氨酸羟化酶、吩噁嗪酮合成酶、white和scarlet转运子。变异位点筛查分析表明，犬尿氨酸羟化酶编码基因Nlkmo存在一个5nt的插入，致使翻译提前终止，破坏了2个跨膜螺旋。其次，为了验证Nlkmo既是褐飞虱红眼突变体发生的靶标基因，本项目进行了3个方面的验证工作，分别为转录本水平分析、RNAi干扰分析和异源表达蛋白活性分析。转录本分析表明，突变体的Nlkmo基因表达水平显著低于野生型个体，仅为野生型个体的35.32%。RNAi分析表明，注射dsRNA使Nlkmo转录本水平下降了58.45%，复眼眼色部分变为红色。Nlkmo基因的野生型（NlKMO-wild）和突变型（NlKMO-mutant）异源表达蛋白活性分析表明，NlKMO-wild蛋白具有犬尿氨酸加氧活性，使犬尿氨酸转化为3-羟基犬尿氨酸，而NlKMO-mutant蛋白检测不到活性。综合这三方面的结果表明，Nlkmo基因的5碱基插入使褐飞虱出现红眼突变表型。褐飞虱红眼突变机理的明确可促进褐飞虱及相近昆虫的复眼及体壁着色机理的研究。