As(Ⅲ)依赖的RNA切割型脱氧核酶的磁珠展示快速定量筛选方法研究

DNAzymes, as catalytic DNA molecules, have been widely applied in analytical chemistry especially in biosensors for detection of heavy metal ions. Unfortunately the conventional SELEX method for obtaining DNAzymes is time-consuming, easy to fail and does not produce DNAzymes with optimal activities. As a solution to this important problem, in order to generate RNA-cleaving DNAzymes that specifically depend on the severe heavy metal pollutant As(Ⅲ), we propose to develop a rapid and quantitative particle-display screening method based on our experience of rapid in-vitro screening for aptamers that bind to heavy metal ions (ACS Nano 2016). To achieve this goal, we will develop a powerful screening strategy wherein the activities of individual DNAzymes from a large library can be measured in high-throughput, by displaying them on synthetic particles via emulsion PCR and isolating only those with highest activities via fluorescence activated cell sorting (FACS). We will optimize the method through the adjustment of screening strategy and conditions to promote the directed evolution of the DNAzyme pool and accelerate the discovery of DNAzymes with high quality. Applications of the DNAzyme products will be further explored as fluorescent biosensors for the detection of As(Ⅲ). The success of the project will highly improve the screening efficiency for generating DNAzymes and thus prosper their applications in the fields of environmental monitoring and food safety.

脱氧核酶作为具有催化作用的DNA分子在分析化学尤其是重金属离子生物传感器方面得到了广泛应用。然而传统获得脱氧核酶的指数富集配基系统进化技术存在时间长、易失败、产物性能不佳等缺陷。为解决这一重要问题，本项目针对尚未获得的严重重金属污染物As(Ⅲ)依赖的RNA切割型脱氧核酶，基于申请人对重金属离子核酸适配体快速体外筛选的经验（ACS Nano 2016），研究磁珠展示快速定量筛选高性能脱氧核酶的新方法：拟结合乳液聚合酶链反应和流式细胞筛选技术，将核酸文库转化为磁珠文库，高通量测量每个备选核酸序列的催化活性并主动分离具有高度活性的序列。通过调控筛选策略和条件，加快核酸库定向演化进程，提高脱氧核酶获取的速度及性能。在获得高性能产物基础上，作为应用上的继续和深化，设计构建检测As(Ⅲ)的高性能荧光型生物传感器。本项目研究成果可以提高脱氧核酶的筛选效率，在环境监测和食品安全等领域都具有重要意义。

随着我国城镇化和工业化的飞速发展，重金属污染问题也日益严重。重金属的现场快速筛查需要开发新型快速检测方法，然而目前快速检测方法的核心即分子识别元件相对匮乏。针对这一问题，本项目以严重重金属污染物As(Ⅲ)的核酸探针为对象，基于磁珠展示方法研究快速定量筛选其高性能核酸探针的新方法，并在此基础上构建快速检测As(Ⅲ)的高性能生物传感器。项目组结合乳液聚合酶链反应和流式细胞筛选技术，将核酸文库转化为磁珠文库，高通量测量每个备选核酸序列的活性并主动分离具有高度活性的序列。通过筛选策略和筛选条件的调控，优化了As(III)核酸探针的快速筛选流程。随后项目组巧妙地设计了双链DNA分子力钳来实现核酸分子的拉伸，并采用简单的延时凝胶电泳方法在平衡状态下测定了核酸分子的折叠能量，建立了核酸探针性能评价的新方法。在获得高性能产物基础上，搭建了基于电解质栅控石墨烯场效应晶体管（SGGT）的电化学生物传感平台，深入分析了SGGT在不同体系中的沟道电流响应机理；通过核酸探针的功能化修饰，优化了SGGT对As(III)的特异性响应信号，实现了实际样品中As(III)的超灵敏快速检测。本项目研究成果对重金属离子的核酸探针筛选及快速检测提供理论基础，在食品安全和环境监测等领域都具有重要意义。本项目共发表高质量论文9篇（其中1篇发表于著名期刊JACS并入选内页封面），申请发明专利2项，参与制定国家标准1项。