Survivin启动子调控下RNAi抑制GRP78对肝癌细胞放射敏感性的影响

One of the major dilemmas of liver cancer radiotherapy is the dose limitation of normal liver tissue. How to increase the radiosensitivity of liver cancer cell is of great significant. In recent years, studies have shown that endoplasmic reticulum stress (ERS) is closely related to the radiation sensitivity. Based on this, this project intends to decrease the expression of glucose-regulated protein 78 (GRP78), the key molecules in the endoplasmic reticulum stress, to investigate the radiosensitivity of tumor cells. At the same time we use Survivin promoter, an effective radiation-induced tumor-specific promoter in our previous study as a tumor targeting tools to achieve suppression of GRP78 in liver cancer cells and avoid affecting the normal liver tissue, in order to achieve effective radiosensitizer.

肝癌放疗的主要困境之一在于正常肝组织对辐射剂量的限制，寻求增加肝癌细胞放疗敏感性的方法具有重要意义。近年来研究表明，内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）与放疗敏感性有密切关系。基于此，本课题拟针对内质网应激中的关键分子葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein，GRP78）进行干预，探讨其对肿瘤细胞放疗敏感性的影响，同时，采用我们前期研究中应用的一种有效的放射诱导肿瘤特异性启动子--Survivin启动子，作为肿瘤靶向性工具，实现在肝癌细胞中抑制GRP78，而避免影响正常肝组织的GRP78，以期达到有效的放疗增敏作用。

肝细胞癌(HCC)是最常见恶性肿瘤之一，分子遗传学基础尚未充分阐明。GRP78是HCC发生的一个关键基因。本课题以内质网应激相关蛋白GRP78等为对象，探讨其对肿瘤细胞的影响，期待探索增加肝癌治疗疗效的新途径。研究表明，应用衣霉素，DTT等内质网应激诱导剂使细胞发生内质网应激的同时，会导致PI3K/AKT/mTOR等信号通路的变化，构成复杂的调控网络。为进一步研究其分子水平上的相互作用，我们以肝癌HepG2细胞为研究对象，分别检测了Survivin mRNA水平的表达；同时检测了低剂量辐射条件下Survivin基因表达的变化。同时从人肝癌细胞系HepG2细胞中克隆Survivin基因的基本启动子，并将之构建到带荧光素酶报告基因的真核表达载体pGL3-Basic上，测定其在肝癌细胞中的转录活性，为进一步构建条件复制腺病毒奠定基础。我们在加州大学旧金山分校 Xin Chen 教授指导下，通过团队的合作，应用gateway 载体克隆方法构建的质粒，通过高压尾静脉注射技术，沉默抑癌基因Pten 联合过表达癌基因c-Met 建立了新的肝癌小鼠模型(简称sgPten/c-Met小鼠肝癌模型)，在肝癌临床样本、细胞系和基因工程小鼠上开展的一系列研究，证实mTOCR2 在肝癌发生中发挥关键作用。在sgPten/c-Met 肝癌模型中，AKT/mTOR 通路激活, p-AKT（S473和T308）增加，AKT 底物（p-c-Raf，p-GSK3 和p-PRAS40）的表达上调；mTOR通路下游的p-4EBP1 和p-RPS6 相应上调。引人注目的是，在sgPten/c-Met 小鼠肝癌模型中，当阻断mTOCR2 通路后可完全阻止小鼠肝癌的形成。Rictor在sgPten/c-Met小鼠成瘤过程中起关键作用，这种作用是通过AKT的磷酸化介导的。探讨SGK3在肝癌发生发展过程中的作用。应用gateway 载体克隆方法构建的质粒，通过高压尾静脉注射技术，分别将PI3K E545K/c-Met，PI3K H1047R /c-Met及sgPten/c-Met注射Sgk3+/+、Sgk3-/-转基因鼠中，结果发现PI3K E545K/c-Met在两组鼠中成瘤存在差异，而其它两组不存在差异，说明SGK3在PI3K E545K/c-Met诱发肝癌过程中起重要作用。