调控榛子胚珠充实的MADS盒基因筛选鉴定及其作用机理研究

Hazelnut (Corylaceae, Corlus L.) is an important nut species and has great economic value. Normal ovule development and filling is the prerequisite and physiological base of edible kernel. Obstacles in development and filling process will cause the formation of flat kernel and empty fruit frequently. Which genes and how they are involved in the regulation of ovule filling process in hazelnut remains blurry. SHP, STK, AG and SEP in MADS-box gene family are involved in determining development of ovule according to the floral quartet model of flower development. In total, 76 MADS-box genes and 8 ovule development related candidate genes have been identified in our existing transcriptome data. Base on these results, the expression of MADS-box genes in the ovule developmental process and its relationship with ovule development will be determined, and the key MADS-box genes regulating ovule development will be verified. Subsequently, the cloning, in situ mRNA hybridization analysis, yeast two-hybrid analysis, genetic transformation of overexpression/ inhibition expression of some important MADS-box genes will be carried out to verified their biological functions during ovule filling process. Finally, chromatiImmuoreciitation-sequencing (ChIP-Seq) will be performed to explore the target genes of the key MADS-box protein, and ovule filling mechanism mediated by MADS-box genes will be illuminated. The present study will provide scientific basis for hazelnut breeding.

榛子是具有重要经济价值的榛科榛属植物。榛子胚珠的正常充实是种仁形成的生理基础，充实障碍可频繁导致瘪仁及空壳果实的形成，哪些关键基因参与及其如何调控胚珠充实过程尚不明确。依据拟南芥的四因子花发育模型，MADS盒基因中的SHP、STK、AG、SEP等基因决定胚珠发育。在已有的榛子转录组数据中已鉴定了76个MADS盒基因和8个胚珠败育候选基因。在此基础上，本项目拟对已有转录谱数据进行挖掘，深入研究胚珠充实进程中MADS盒基因表达与胚珠发育间的相互关系，确定参与胚珠充实调控的关键MADS盒基因。进而开展关键MADS基因克隆、组织mRNA原位杂交、酵母双杂、过量/抑制表达遗传转化等研究，多角度正反验证其在胚珠充实中的生物学功能。最后，用染色质免疫共沉淀测序技术研究关键MADS蛋白下游的靶基因，解析MADS盒基因调控胚珠充实的作用机理。本研究为榛子优良品种选育提供了科学依据。

榛子是具有重要经济价值的榛科榛属植物。榛子胚珠的正常充实是种仁形成的生理基础，充实障碍可频繁导致瘪仁及空壳果实的形成，哪些关键基因参与及其如何调控胚珠充实过程尚不明确。本项目对已有转录谱数据进行挖掘，深入研究胚珠充实进程中MADS盒基因表达与胚珠发育间的相互关系，确定参与胚珠充实调控的关键MADS盒基因。进而开展关键MADS基因克隆、组织mRNA原位杂交、酵母双杂、过量/抑制表达遗传转化等研究，多角度正反验证其在胚珠充实中的生物学功能。最后，用染色质免疫共沉淀测序技术研究关键MADS蛋白下游的靶基因。本项目完成了榛子基因组二代与三代测序，构建了榛子基因组数据库，结合已有的榛子转录谱数据，去冗后获得59个 MADS 盒基因，它们分布于11条染色体上，其相应蛋白长度为89-524个氨基酸。所有MADS基因可分为I型与II型，其中I型有16个成员，II型有43个成员。在四个胚珠发育阶段，48个CHMADS的表达丰度保持在低水平，且相邻时期的表达没有显著差异。CHMADS（ChMADS11/15/16/19/20/32/33/37/42/43/45）在一个或几个发育阶段表现出相对较高的表达，表明它们可能与胚珠发育有关。mRNA原位杂交结果证实ChAG, ChSHP和ChSEP1 在胚珠中大量表达。Y2H实验表明ChAG、ChSHP和ChSEP能够发生相互作用。制备了ChSEP1的蛋白抗体开展IP-seq分析，发现胚珠受精前后分别有20%和58%左右的 ChSEP 结合在基因组的启动子区，ChSEP在受精后通过与启动子区的结合来活化下游基因的表达进而参与胚珠的发育调控，认为ChSEP一方面通过与其他MADS基因的启动子结合来调控MADS基因间的互作，同时与下游植物激素生物合成和信号转导中的关键基因和蔗糖转运相关基因的启动子相结合，参与胚珠发育调控进程。本研究为榛子优良品种选育提供了科学依据。