缺血/低氧预适应脑内特定miRNAs-PKC亚型特异性信号通路生物学验证及其抗脑缺血/低氧损伤作用

Ischemic/hypoxic preconditioning (I/HPC) is a phenomenon of ischemia/hypoxia pretreatment-evoked endogenous neuroprotection, which may provide new idea for the prevention and treatment of ischemic/hypoxic injuries-related brain disease. Unfortunately the accurate signal transduction mechanism of I/HPC is not clear. Our previous reports have confirmed that the classical protein kinase C (cPKC) betaII, gamma and novel PKC (nPKC) epsilon-interacting proteins, and 19 differentially expressed miRNAs were involved in the cerebral I/HPC development. Based on the network prediction of specified miRNAs-PKC isoform-specific signaling pathways, we will further explore the formation of cPKC interacting protein involved in the HPC，the correlation of PKC isoform-specific interacting proteins with the degree of cerebral injuries, and the role of miRNAs-PKC isoform-specific signaling pathways in brain ischemic/hypoxic injuries and neuroprotection by using I/HPC and middle cerebral artery occlusion (MCAO)-induced ischemic stroke mouse models.

脑缺血/低氧预适应(I/HPC)是缺血/低氧预刺激诱发的一种内源性神经保护现象。这一现象的发现为临床缺血性脑疾病的防治提供了新思路，但其发生发展的确切细胞信号转导机制尚不清楚。我们前期工作发现，经典蛋白激酶C(cPKC)betaII、gamma 及新奇型PKC (nPKC)epsilon三亚型的118个相互作用蛋白，以及19个差异表达miRNAs参与了脑I/HPC 的形成，初步预测了差异表达miRNAs-PKC亚型特异性信号蛋白网络。本课题拟利用小鼠整体I/HPC和脑中动脉阻塞致局部缺血性卒中模型，进一步验证PKC 亚型特异性相互作用蛋白与脑损伤程度的关系，阐明特定miRNA-PKC亚型特异性相互作用蛋白信号网络在脑缺血/低氧性损伤和保护中作用。所获成果将进一步丰富人们对脑I/HPC形成机制的认识并指导临床。

本课题是在前期发现经典蛋白激酶C(cPKC)betaII、gamma 及新奇型PKC (nPKC)epsilon三亚型的118个相互作用蛋白，以及19个差异表达miRNAs参与了脑I/HPC 的形成的基础上，进一步探讨特定miRNA-PKC 亚型特异性相互作用蛋白信号网络在脑缺血/低氧性损伤和保护中的作用。本课题在整体动物水平和离体细胞水平对miR-378、miR-30a进行干预后测定PKC亚型及相互作用的特异性信号蛋白mRNA和蛋白质水平的影响。结果发现miR-378负性调节Caspase-3蛋白表达减轻氧-糖剥夺致N2A细胞缺血损伤；随着OGD时间的延长，自噬相关蛋白Beclin-1表达水平和LC3II/I比值显著升高，30 min达到峰值，之后略有回降；miRNA-30a通过降低Beclin 1介导自噬减轻脑缺血性损伤。cPKCγ和cPKC beta均具有一定的神经功能保护作用， cPKCγ的保护作用是通过其对自噬的调节实现，cPKCbeta的保护作用是通过其对CRMP2磷酸化和水解的调节实现.本课题研究发现cPKC beta激动剂DOPPA减少OGD引起的原代皮层神经元损伤，cPKCbeta通过抑制CRMP2水解减轻MCAO诱导的缺血脑损伤，抑制calpain介导的CRMP2水解保护MCAO损伤小鼠脑组织。cPKCbeta调节CRMP2磷酸化和水解，减轻OGD诱导的小鼠原代培养脑皮层神经元损伤和凋亡。c PKCγ通过Akt-mTOR通路调制神经元自噬减轻缺血性卒中鼠脑损伤。cPKCγ基因敲除增大缺血性卒中鼠脑梗死体积但不影响MCAO术后小鼠局部CBF的变化。cPKCγ基因敲除加重缺血性卒中鼠脑梗死周围区神经细胞丢失导致脑神经功能损伤。与c PKCγ+/+小鼠相比，c PKCγ-/-小鼠梗死周围区内Beclin-1蛋白水平、LC3-II/ (LC3-I+LC3-II)比值明显增高，而梗死周围区内Akt(Ser473)、m TOR(Ser2448)和S6(Ser235/236)磷酸化水平下降更为明显。提示c PKCγ基因敲除降低缺血神经元存活率与其调制Akt-m TOR通路增高缺血神经元自噬水平有关。本研究对miRNA在脑损伤过程中的作用以及蛋白激酶C的作用机制进行了深入探讨，为将来的临床干预奠定了实验基础。