从mTOR介导的自噬途径探讨青蒿琥酯抑制成纤维细胞增殖预防硬膜外纤维化的机制研究

Epidural fibrosis is one of the most common complications after laminectomy. The mTOR signaling pathway is one of the major pathways by negatively regulating cell autophagy levels. Previous studies have shown that artesunate could inhibit the proliferation of epidural scar fibroblasts and promote the expression of autophagy-related proteins in fibroblasts.It is unclear whether The mechanism of artesunate in inhibiting fibroblast proliferation by regulating the mTOR pathway-mediated autophagic pathway. This study was to investigate the mechanism of artesunate in inhibiting the proliferation of fibroblasts and preventing epidural fibrosis by regulating mTOR pathway-mediated autophagy pathway. The effect of artesunate on the autophagy and proliferation of fibroblasts were observed after overexpressing and silencing the mTOR by lentiviral transfection. The animal model of epidural fibrosis was established to elucidate the mechanism of artesunate in inhibiting fibroblast proliferation and preventing epidural fibrosis by regulating mTOR pathway-mediated fibroblast autophagy. This study can clarify the molecular mechanism of artesunate in inhibiting fibroblast proliferation and provide new ideas for prevent epidural fibrosis.

硬膜外纤维化是椎板切除术后最常见的并发症之一。mTOR介导的信号通路是负调控细胞自噬水平的主要通路之一。本课题组前期研究发现青蒿琥酯能够抑制硬膜外疤痕成纤维细胞增殖，并可以促进成纤维细胞中自噬相关蛋白的表达。但青蒿琥酯是否通过调控mTOR介导的途径激活自噬，从而抑制成纤维细胞增殖目前尚不清楚。本研究拟探讨青蒿琥酯通过调控mTOR介导的自噬途径抑制成纤维细胞增殖预防硬膜外纤维化的机制。通过慢病毒转染过表达/沉默mTOR，观察青蒿琥酯对mTOR介导的自噬途径、成纤维细胞自噬及增殖的影响；构建硬膜外纤维化动物模型，从动物体内阐明青蒿琥酯通过mTOR介导的自噬途径调控成纤维细胞自噬，抑制成纤维细胞增殖，从而预防硬膜外纤维化的作用和机制。本研究可明确青蒿琥酯抑制成纤维细胞增殖的分子机制，为预防硬膜外纤维化提供治疗新思路。

研究的背景和目的：成纤维细胞的过度增殖是硬膜外纤维化的主要原因，而ART能抑制成纤维细胞的增殖预防硬膜外纤维化粘连。本研究拟探讨ART对成纤维细胞的影响以及自噬在ART抑制成纤维细胞增殖中的作用及机制研究。.实验方法：制备硬膜外纤维化粘连模型，用不同浓度的ART进行灌胃处理，观察其预防硬膜外纤维化粘连的效果，免疫组化检测标本中增殖、自噬相关蛋白的表达情况。CCK-8检测不同干预对成纤维细胞活性的影响。EdU染色观察成纤维细胞内DNA合成情况，透射电镜观察成纤维细胞内自噬小体的数量，LC3免疫荧光染色观察ART对成纤维细胞自噬的影响。western-blot检测PCNA、Cyclin D1、Beclin-1，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ，Atg5、p62、p-PI3K，PI3K，p-AKT，AKT，p-AMPK，AMPK，p-mTOR，mTOR，p-4E-BP1和p-P70S6K的表达情况。过表达mTOR构建稳定的细胞系，证明mTOR信号通路与ART抑制成纤维细胞增殖的相关性。.实验结果：1.动物实验结果显示ART能有效预防大鼠硬膜外纤维化粘连。ART处理组的标本中PCNA、Cyclin D1、p-mTOR的表达量低于对照组，LC3表达量高于对照组，呈浓度依赖性。2.CCK-8结果表明ART可以抑制成纤维细胞活性，呈时间和浓度依赖性；EdU染色、western-blot结果表明ART抑制成纤维细胞增殖；LC3免疫荧光染色、western-blot及透射电镜结果表明ART可以诱导成纤维细胞自噬；自噬抑制剂3-MA作用后，LC3免疫荧光染色、CCK-8及western-blot结果显示，ART引起的自噬可以被部分逆转，ART对成纤维细胞活力以及增殖能力的抑制作用减轻。3.western-blot结果显示ART抑制mTOR激活途径PI3K/AKT，而激活抑制mTOR信号的AMPK通路，呈浓度依赖性；mTOR过表达后，LC3免疫荧光染色、western-blot结果显示ART诱导的自噬受到抑制；CCK-8、EdU、Western-blot试验显示，ART抑制增殖的作用被部分逆转。.结论：ART能够抑制成纤维细胞自噬，从而抑制其增殖。mTOR介导的信号通路在此过程中起到了关键作用，ART能够通过mTOR介导的信号通路抑制成纤维细胞自噬继而抑制其增殖，预防硬膜外纤维化粘连。