点青霉葡萄糖氧化酶热稳定性关键氨基酸研究

Glucose oxidase (GOD, EC 1.1.3.4) are a class of enzymes that catalyze the oxidation of D-glucose to gluconic acid and hydrogen peroxide. Glucose oxidase has emerged as an important biocatalyst in food industry, such as beverage, gluconic acid production and biosensors. A glucose oxidase GODp from Penicillium notatum F4 exhibits preferable catalytic activity than other glucose oxidases. The poor thermostability, however, limit its application effectiveness. We sought to enhance the structural stability of the GODp using protein engineering, including increase conformational stability and unfolding free energy of the GODp, optimize surface charge distribution, and enhance combination stability between coenzyme FAD and the protein. Firstly, computer-assisted rational design is used to select appropriate amino acid associated with protein thermostability. Then, the mutants are obtained by strategies of site-directed mutagenesis. The purpose is to explore critical sites relate with thermostability of the GODp and how to improve the thermostability of this protein. Furthermore, mutants which exhibited better thermostability than the widetype enzyme are desire to obtain. This research can provide a valid method to improve protein thermostability by way of computer-assisted rational design.

葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，GOD，EC 1.1.3.4）可催化葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，在食品工业如面包烘焙、生产葡萄糖酸以及生物传感器等领域应用广泛。来源于点青霉Penicillium notatum F4的葡萄糖氧化酶GODp与同类酶相比具有更强的催化活性，但其热稳定性较差，并直接影响了其应用范围和使用效果。本研究以稳定酶蛋白整体结构为出发点，从增加蛋白质区域构象稳定性，提高其解折叠自由能，优化蛋白表面电荷分布和增强辅酶FAD结合强度四个层面入手，通过计算机辅助分子模拟分析，选取可能与酶蛋白热稳定性相关的氨基酸，再利用定点突变等理性设计策略进行突变研究，揭示影响GODp热稳定性的关键氨基酸和结构特性，进而获得高效且稳定性好的葡萄糖氧化酶，为通过理性设计改善蛋白质热稳定性的研究提供新思路。

葡萄糖氧化酶可用于食品防腐剂、饲料添加剂等领域。但天然来源的葡萄糖氧化酶热稳定性很差，来源于点青霉Penicillium notatum F4的葡萄糖氧化酶GODp与同类酶相比具有更强的催化活性，但其热稳定性较差，并直接影响了其应用范围。本项目结合计算机辅助模拟计算，评估了GODp中所有氨基酸单点突变对蛋白质解折叠自由能（ΔΔG值）的影响，进而对蛋白质热稳定性的影响。另外，FAD辅基与其周围氨基酸的结合力也可能影响生物学活力乃至蛋白的稳定性。.在此基础上，针对预测的有益突变位点，对单个氨基酸位点进行饱和突变。共构建了9个饱和突变体库，并获得了各个突变体蛋白。.采用多种指标对突变体蛋白的热稳定性进行测试。包括酶活力保留率，半衰期（t1/2），Tm值（染料法和DSC法）。E476库中突变体的热稳定性普遍增强。在D408库中，突变体的热稳定性有提高也有降低，其中D408C在55℃的半衰期比野生型提高172%。而经同样条件处理后，D82库中所有突变体的热稳定性都变差，其中突变体D82T和D82N的剩余酶活力为0。结果表明，D82位点，D408位点和E476位点都是影响GODp热稳定性的关键氨基酸位点。.针对FAD周边6个氨基酸分别构建的突变体库，旨在寻找能够增强FAD与GOD结合能力的突变体，但结果表明这些氨基酸位点突变后对GOD酶活力的影响很大，大部分突变体都丧失了生物学活力，说明FAD存在分子作用力的氨基酸，都与GOD的催化活力密切相关，其位点突变后将普遍丧失生物学活力。.对GODp蛋白质结构的分析表明，D408天冬氨酸位于GODp蛋白表面α-螺旋区，当该位点突变后，由于苏氨酸和色氨酸的分子刚性更强，使得该区域甚至该α-螺旋区的稳定性进一步增强，相应的热稳定性也变得更好。这证实了Prethermut的预测结果。D82天冬氨酸位于GODp蛋白表面loop区，与84位的天冬酰胺形成氢键，而且此区域紧邻FAD辅基，可能对GODp的催化活力影响较大。突变体破坏了原有的区域稳定结构，甚至进而影响到FAD辅基周围氨基酸的空间构象，导致蛋白质稳定性急剧下降。E476是稳定相邻两个α-螺旋结构的重要作用力。当其突变为非电离极性氨基酸后，两个氢键距离缩小，相邻两个α-螺旋结构能够耐受更高的环境温度，热稳定性提高。该研究为解析影响葡萄糖氧化酶热稳定性的关键氨基酸提供了理论和实际借鉴。