解析猪外耳面积因果突变PPARD G32E的分子机理

We have previously identified a causative mutation, PPARD G32E, underlying a major QTL effect on external ear size in pigs. To elucidate the molecular mechanism of the mutation, we are planning to do the following experiments.Ear size is closely related to chondrocyte prolifertaion in the cartilage of mice, and our pilot experiments showed that PPARD attenuated porcine external ear-driven chondrocyte proliferation of White Duroc when the ligand of PPARD treated cells. The G32E substitution reduced ligand-dependent transcription activity of PPARD by altering its original subcellular localization and post-translational localization. According to these previous results,we proposed that PPARD G32E increased ear size by promoting ear chondrocyte proliferation. Considering that the G32E substituion is a loss-of-function mutation, we will use RNA-Seq to compare the differences in transcriptome between two different genotyped pinna chondrocyte. And we will test the difference of binding target genes between wild type PPARD and G32E mutant using Chip-Seq. By combining the above results, we will finally uncover the underlying molecular mechanism of PPARD G32E for external ear size in pigs.

本项目在申请人前期已确定控制猪耳廓大小的因果突变PPARD G32E 的基础上，拟从细胞和分子水平阐释该突变导致耳廓增大的分子机理。耳廓大小与软骨细胞的增殖密切相关，根据PPARD是核激素受体的特征，课题组用PPARD特异配基处理野生型耳廓软骨细胞，发现配基抑制了耳廓软骨细胞的生长。此外，课题组前期已从分子水平证明G32E是缺失突变，该突变显著降低了其靶基因的转录水平。我们由此假设G32E 突变破坏了野生型PPARD对于软骨细胞增殖的抑制作用。根据PPARD 是核激素受体的特性，我们拟用PPARD 特异配基处理野生型猪耳廓软骨细胞，用RNA-Seq 检测配基处理耳廓软骨细胞后基因表达量的差异， 用Chip-Seq 检测PPARD 野生型和突变型在基因组中结合位点的差异，整合上述结果最终阐明G32E致耳廓生长加速机理。

【背景】申请人前期确定了控制猪耳廓大小的因果突变PPARD G32E，并从分子水平证明G32E是缺失突变，该突变显著降低了其靶基因的转录水平。此外，根据PPARD是核激素受体的特征，课题组用PPARD特异配基处理野生型耳廓软骨细胞，发现配基抑制了耳廓软骨细胞的生长。然而，PPARD G32E导致猪耳廓增大的分子机制仍未知。. 【结果】课题组从活体和细胞学水平分析发现PPARD抑制耳廓软骨板的生长是由于PPARD加速了软骨前体细胞的凋亡、软骨板细胞的分化及其降解软骨板的作用。通过转录组测序，我们发现激活PPARD增加了一系列与软骨前体细胞凋亡及其向软骨分化相关基因的表达，同时增加了软骨细胞的最终分化和细胞外基质降解基因的表达。通过染色质免疫共沉淀方法，我们确定PPARD是一个现已知的控制软骨发育的关键基因PPARG。我们进一步发现野生型PPARD可以下调PPARG的表达，最终导致那些抑制软骨生长的关键基因的上调。整合课题组现在的发现及过去的报道，我们提出一个解释PPARD G32E导致猪外耳面积增大的模型。G32E突变促进了PPARD向核外运输并且减少了PPARD A/B结构域泛素化的水平，最终导致PPARD转录活性降低。携带有G32E突变型的二花脸猪迟滞了软骨前体细胞的凋亡、成软骨细胞的最终分化和耳廓软骨板的降解。最终，导致成软骨细胞的长期存在、不断分泌软骨基质，造成突变型G32E个体大的耳廓。相反，野生型猪如杜洛克有正常生物活性的PPARD，由此造成，比野生型有更小的外耳面积。. 【结论】总之，课题组确定PPARD是一个猪耳廓软骨板生长的关键抑制子。G32E突变由于显著降低了PPARD控制的耳廓软骨板发育迟滞效应，造成更大的猪耳。该发现加深了我们对于哺乳动物耳廓发育机制的了解，也为今后在软骨再生医学和在耳畸形治疗中以PPARD为靶点开发药物奠定基础。