TGF-β1介导的信号通路诱发EMT在纳米NiO致肺纤维化中的作用

To explore the toxic effect of nano nickel oxide (NiO) is beneficial to the rapid development of nanotechnology. Studies confirmed that nano NiO can cause lung injury in rats, but the mechanisms of pulmonary fibrogenesis induced by nano NiO are still scarcely. Our previous study found that the potential mechanism of pulmonary fibrosis induced by nano NiO is the activation of TGF-β1 signaling pathway leaded to the occurrence of EMT and the imbalance of MMPs/TIMPs. Firstly, this project aims to establish the A549 cell damage model induced by nano NiO, and explore the realtionship between the pulmonary fibrosis induced by nano NiO and TGF-β1/Smads signaling pathway, TGF-β1/MAPK signaling pathway, EMT, MMPs/TIMPs. Furthermore, the A549 cell will be cultured with nano NiO, SB431542, U0126 and SB203580 to demonstrate the precise and integrated mechanisms of pulmonary fibrosis by the methods of cellular immunity fluorescence, ELISA, RT-qPCR and Western blot, which will provide a valuable clue for prevention lung toxicity induced by nano NiO.

纳米氧化镍（nickel oxide，NiO）的毒效应研究有利于纳米技术的快速发展。研究证实，纳米NiO可致大鼠肺组织损伤，但有关肺纤维化及其机制研究未见翔实报道。我们前期预实验研究证实纳米NiO致大鼠肺纤维化，其机制可能为纳米NiO激活TGF-β1介导的信号通路，进而诱发EMT发生及MMPs/TIMPs失衡。因此，本项目在建立纳米NiO致A549细胞损伤模型基础上，采用TGFβR1抑制剂SB431542、ERK抑制剂U0126和p38抑制剂SB203580预处理细胞，应用ELISA、RT-qPCR、Western blot和细胞免疫荧光等方法，探讨TGF-β1/Smads信号通路、TGF-β1/MAPK信号通路、EMT发生和MMPs/TIMPs平衡与纳米NiO致肺纤维化的关系，阐明其致纤维化可能分子机制，为纳米NiO肺毒性防治提供有价值的参考。

研究发现纳米NiO可致大鼠肺纤维化，但详细机制尚不清楚。本项目建立体外培养的A549细胞毒性模型，探讨TGF-β1介导的Smad和MAPK信号通路在纳米NiO致A549细胞胶原形成中的作用及其潜在的分子机制。研究结果显示，随着纳米NiO处理浓度（12.5、25、50、100和200μg/mL）和时间（6、12、24、36和48h）的增加，细胞存活率呈下降趋势。选择25、50和100μg/mL纳米NiO处理A549细胞24h，结果发现100μg/mL纳米NiO组细胞培养基中Hyp含量和细胞中Col-I的蛋白表达水平增加，细胞培养液中TGF-β1含量增加。纳米NiO各处理组A549细胞Smad2、Smad3、α-SMA、vimentin、fibronectin、ERK1/2、p38、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的mRNA表达水平升高，而E-cadherin的mRNA表达降低。TGF-β1、α-SMA、vimentin、fibronectin、MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2蛋白水平，以及Smad2、Smad3、p38和ERK1/2的蛋白磷酸化水平升高，而E-cadherin蛋白表达水平降低。根据上述实验结果，进一步选择100μg/mL纳米NiO分别联合TGF-β1、p38和ERK1/2抑制剂处理A549细胞。结果显示，纳米NiO+SB431542、纳米NiO+SB203580和纳米NiO+U0126组各自的细胞存活率均升高。纳米NiO+SB431542处理组细胞Smad2、Smad3、p38和ERK1/2的蛋白磷酸化水平以及Col-I、α-SMA、vimentin和fibronectin蛋白表达水平均下降，而E-cadherin表达水平升高。纳米NiO+SB203580组和纳米NiO+U0126组细胞p38和ERK1/2的蛋白磷酸化水平以及Col-I、MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的蛋白表达水平均低于纳米NiO组。结果表明，纳米NiO可诱导A549细胞胶原过量形成，其机制可能与TGF-β1介导的Smad和MAPK信号通路活化、EMT发生以及MMPs/TIMPs失衡有关。本研究结果将为纳米NiO致肺纤维化的预防和治疗提供理论基础。