巨噬细胞自噬与极化异常促使双膦酸盐性颌骨坏死的机制研究

At present, there is still a lack of effective therapy for bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw (BRONJ). A series of evidence have implied that the macrophages-mediated dysfunctional bone turnover attributable to bisphosphonate treatment causes osteonecrosis of the jaw, followed later by an infection. However, the roles of macrophages and the underlying mechanisms in BRONJ are still largely unknown. Our previous studies revealed that BPs inhibited the autophagy activity of macrophages and promoted macrophages towards M1 polarization. In the present study, firstly, the models of BRONJ and in vitro cells will be established to explore the role of autophagy in macrophages polarization and their regulatory mechanisms in BRONJ. Secondly, Lyz2-Cre: Atg5f/f conditional knockout mice will be employed to further analyze the role of macrophages autophagy in the development of BRONJ. Lastly, the therapeutic effect and feasibility of rapamycin-loaded poly(lactic-co-glycolic) acid nanoparticles will be applied to prevent the development of BRONJ. Collectively, this study may provide a new insight into the biological roles of macrophage in BRONJ, and offer a novel therapeutic target to BRONJ.

目前，双膦酸盐性颌骨坏死（BRONJ）尚缺乏有效的治愈手段。研究表明，双膦酸盐（BPs）作用下的骨转化障碍可能是骨坏死的主要原因，其中，巨噬细胞扮演关键角色。然而，巨噬细胞在BRONJ发生中的调控机制仍不清楚。我们前期研究发现：BPs影响巨噬细胞自噬和极化。本项目拟从巨噬细胞介导骨转化这一全新的视角，通过BRONJ模型和体外细胞学模型，并结合巨噬细胞条件敲基因小鼠Lyz2-Cre:Atg5f/f，设计系列体内外实验，阐明自噬调控巨噬细胞极化在BRONJ发生中的作用及相关分子机制，探索基于巨噬细胞自噬的载药生物材料防治BRONJ的有效性和可行性。本研究不仅对认识BRONJ的发病机理具有重要意义，而且为临床防治BRONJ提供新思路。

本研究聚焦于巨噬细胞引导的骨转化障碍在双膦酸盐性颌骨坏死（BRONJ）发生中的具体调控机制，分别从巨噬细胞极化异常，线粒体自噬异常，胞葬功能障碍及诱导内皮细胞血管生成障碍等多种角度，通过小鼠模型及细胞学模型，并结合条件基因敲除小鼠，设计系列体内外实验，阐明了巨噬细胞在BRONJ发生中的重要作用及相关分子机制。结果表明： .（1）唑来膦酸（ZA）诱导TLR-4介导的M1型巨噬细胞极化参与BRONJ。体外实验表明巨噬细胞在ZA处理后呈现出明显的M1极化趋势，并释放炎症因子。通过转录组水平分析，我们发现ZA首先通过巨噬细胞膜受体TLR-4活化TLR-4/NF-κB信号通路，进而被巨噬细胞内吞。TLR-4小分子抑制剂TAK-242可明显减少小鼠BRONJ发生。.（2）ZA通过活化TLR-4/NF-κB通路介导线粒体损伤及自噬功能抑制参与BRONJ。ZA导致小鼠颌骨组织内巨噬细胞线粒体自噬水平的下降，TLR-4通路激活下游NF-κB通路，降低线粒体自噬水平，从而导致细胞内ROS堆积，最终导致巨噬细胞向M1方向极化，参与了BRONJ发病。ZA与自噬激活剂雷帕霉素（RAPA）的复合型新药ZDPR在体内外水平均可以提高线粒体自噬水平，改善巨噬细胞极化异常，并有效预防BRONJ。.（3）ZA通过抑制巨噬细胞胞葬促进BRONJ。ZA可通过降低巨噬细胞胞葬功能并同时诱导骨组织细胞凋亡，造成骨组织中凋亡细胞增多；另一方面通过阻碍BMDMs中Rac1膜移位抑制BMDMs的胞葬。Rac1异戊二烯化底物类似物香叶基香叶（GGOH）可部分恢复ZA导致的BMDMs胞葬抑制效应。体外小鼠模型数据显示GGOH可明显减少ZA导致的骨组织相关细胞凋亡，并有效促进BRONJ模型鼠拔牙创的愈合。.（4）巨噬细胞外泌体通过miR-149-Rap1a/Rap1b 抑制血管生成促进BRONJ。BRONJ小鼠颌骨拔牙创愈合过程中新生微血管减少，miRNA高通量测序、蛋白免疫印迹及双荧光素酶报告基因实验结果表明：ZA作用下巨噬细胞外泌体通过miR-149-Rap1a/Rap1b-VEGFR轴调控内皮细胞增殖、迁移、成血管功能。局部应用miR-149抑制剂antagomiR-149可有效防治BRONJ。.通过本项目的研究，不仅对加深了认识BRONJ的发病机理具有重要意义，而且为临床防治BRONJ提供新思路。