PHRF1在DNA损伤应答通路中的功能与作用机制研究

DNA damage response pathway (DDR) is essential for maintaining genome stability in mammalian cells. Ubiquitin proteasome system (UPS) plays an important role in DDR, including cell cycle checkpoint, DNA repair and apoptosis. Recent researches indicated that E3 ubiquitin ligase RNF8 is a key component of DDR. However, the molecular mechanism by which RNF8 itself is regulated remains elusive. By genome-wide screening, we identified a new E3 ligase PHRF1, which can interacts with RNF8 in a DNA damage-dependent manner. PHRF1 also can regulate 53BP1 foci and CHK1 phosphorylation. In this project, we will continue to investigate the detailed function of PHRF1 in DDR. In the current application, we propose the following Specific Aims: (1) How does PHRF1 regulate RNF8 ubiquitination? (2) the detailed function of PHRF1 in maintaining genome stability; (3) Determine the role of PHRF1 in tumorigenesis using clinical samples and transgenic mice models.

DNA损伤应答（DDR）是哺乳动物细胞维持基因组稳定的重要机制。泛素蛋白酶体系统（UPS）通过调控DDR通路蛋白的泛素化发挥作用。E3泛素连接酶RNF8在DDR中扮演重要的角色，但RNF8自身的调控仍不清楚。我们通过基因组范围的功能筛选，鉴定了一个全新的泛素连接酶PHRF1能够直接调控RNF8功能。PHRF1能与RNF8形成复合物并调控RNF8和53BP1的foci形成。目前PHRF1的作用机理未知，因而对其进行功能研究将有助于更深入了解泛素化修饰在DDR中的作用机制，有助于发掘新的肿瘤标志物。本研究目标是，在细胞及动物模型水平上验证PHRF1是否参与DNA损伤修复应答，并阐明其分子机制。本研究将进行如下探索：（1）PHRF1调控RNF8泛素化修饰的分子机理；（2）PHRF1调控基因组稳定性的分子机理；（3）用临床病理组织样本和动物模型研究PHRF1在维持基因组稳定性和肿瘤形成中的功能。

泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin proteasome system，UPS)可通过调控参与DDR多种蛋白质的泛素化修饰来调控DNA修复，该系统中的E3泛素连接酶RNF8在DNA损伤修复调控中扮演了重要的角色，但RNF8自身的调控机制尚不清楚，这在DNA损伤修复领域是一个非常重要的问题。我们前期通过基因组范围的功能筛选，鉴定出一个全新的泛素连接酶PHRF1能与RNF8形成复合物并调控RNF8和53BP1的foci形成。DNA损伤后，PHRF1能被招募到DNA损伤位点，ATM对于PHRF1的磷酸化修饰是PHRF1招募所必需的。机制上，PHRF1能泛素化修饰RNF8，该泛素化修饰影响到RNF8和MDC1的相互作用，进而影响到RNF8及其下游53BP1在DNA损伤位点的招募，最终影响DNA损伤修复的NHEJ通路。敲低PHRF1影响到CHK1、CHK2介导的细胞周期检测点，并影响到染色体稳定性。这部分工作深入探讨了PHRF1分子在DSB损伤修复应答通路选择中的功能，阐明了PHRF1对于RNF8的分子调控机制，部分解析了本领域内的一个重要问题（文章在投）。.此外，我们还对其他UPS分子在DDR中的功能进行了深入研究。在DNA损伤后HR或NHEJ修复通路的选择中，一个悬而未决的问题是BRCA1在S期如何调控RIF1从DNA损伤位点解离从而促进HR修复。针对这一问题，我们鉴定出一个全新的泛素连接酶UHRF1参与到DNA损伤修复应答调控中。敲低UHRF1能促进HR、抑制NHEJ。UHRF1在DNA损伤后被招募到DNA损伤位点，且UHRF1的招募依赖于BRCA1。UHRF1能和NHEJ通路导向的调控蛋白Rif1相互作用并泛素化修饰Rif1使其从DNA损伤位点上解离下来。敲低UHRF1能抑制BRCA1 foci的形成，而延迟53BP1 foci的消失。以上数据表明，BRCA1-UHRF1能拮抗Rif1-53BP1的功能，在DNA损伤修复通路的选择中起重要作用（Nat. Commun.,2016）。针对DNA末端剪切步骤，我们对其中核心分子CTIP的相互作用分子进行了蛋白质组学水平的挖掘，发现去泛素化酶USP4直接参与DSB切除和同源重组。USP4通过与CtIP及MRN互作，调控了CtIP招募。USP4自身去泛素化是其中发挥功能的必要条件（Cell Reports, 2015）。