临床核糖体型别不同的艰难梭菌A、B毒素基因多态性研究

艰难梭菌已逐渐成为成人腹泻、尤其是医院感染的重要病原菌之一，临床可引起伪膜性结肠炎，发生巨结肠或肠穿孔时，死亡率高达35-50%。艰难梭菌的主要致病因子是A、B毒素，并且常常同时携带A、B毒素。但是，目前研究发现亚洲、我国艰难梭菌A毒素阴性B毒素阳性菌株分离率明显高于欧美国家。全基因组测序分析发现不同区域艰难梭菌A、B毒素基因存在高度变异性。本研究拟对我国不同来源的10余种核糖体型别的70株艰难梭菌A、B毒素基因进行Sanger测序分析，建立我国艰难梭菌A、B毒素基因多态性图谱和数据库，并与国际艰难梭菌全基因组测序株进行生物信息学对比，探明我国艰难梭菌A、B毒素遗传变异规律；筛选特异性位点，建立、评价我国特异的艰难梭菌A、B毒素分子检测、分型方法，为艰难梭菌的临床病原检测、鉴定提供有效手段，为研究不同毒素表型菌株的致病机制奠定基础。对艰难梭菌感染的防治具有重要意义。

在本项目中课题组按计划完成了各项任务。艰难梭菌是一种革兰氏染色阳性、厌氧芽孢杆菌，可导致抗生素相关腹泻，目前已成为导致院内感染的第一位病原，艰难梭菌感染可作为抗生素不合理使用的指示菌。课题组从5个监测点及国际交流收集得到88菌株，进行了AB毒素基因检测、核糖体分型和多位点序列分型。针对tcdA设计了9对测序引物，针对tcdB设计了8对测序引物，对70株艰难梭菌菌株的tcdA/B进行了测序。对本研究中获得的tcdA/B基因序列和从Genbank数据库中收集的序列进行了生物信息学分析，发现了tcdA/B基因的多态性特征和进化特点。tcdA/B均具有较高的多态性，其中tcdB的多态性位点远高于tcdA。85条tcdA基因序列和95条tcdB基因序列均可分为16个型别。中国流行的ST37型菌株与国外高致病性RT027型菌株的B毒素基因均与同一株早期分离高毒株的B毒素基因的不同结构域具有高度同源性，可能由重组造成，提示了B毒素基因进化过程中可能发生的变异，对高致病菌株毒力研究具有一定提示。对保守位点进行了引物设计，建立了针对中国艰难梭菌特异性更高的检测方法，对今后的流行病学监测和临床快速监测具有重要意义。本研究中有少部分菌株无法使用所设计的引物进行扩增测序，提示这一部分菌株的变异更高，需要使用其他方法进行深入研究。