NEK4在TNF诱导的细胞程序性坏死过程中的作用及机制研究

Programmed necrosis or necroptosis is a newly discovered mode of cell death. It has been evaluated that disrgulation of necroptosis is of central pathophysiological relevance in diverse human diseases. The formation of RIP1/RIP3 necrosome is the key step of TNF-induced necroptosis, but the mechanism is still largely unknown. In our previous work, through screening a shRNA libirary to identify the important regulator of TNF-induced necroptosis, we found that knockdown of NEK4 expression significantly surpressed TNF-induced necroptosis. We further found that the decrease of NEK4 blocked RIP1 and RIP3 activation during TNF-induced necroptosis. These results suggested that NEK4 might mediate TNF-induced necroptosis by regulating the formation of necrosome. Based on these observations, we plan to use multiple methods including immunopricipitation, kinase assay, mice suvival analysis in the NEK4 knockdown cells and knockout mice to better understand the molecular mechanism by which NEK4 regulates TNF-induced necroptosis. Our study will shed light on the mechanisms of necroptosis related diseases.

程序性坏死或necroptosis是近年来被发现的一种新的细胞死亡形式，其调控紊乱与多种人类疾病密切相关。在TNF诱导的necroptosis过程中，RIP1/RIP3坏死小体的形成是关键步骤，但其具体调控机制并不清楚。我们在前期工作中，通过大规模shRNA文库筛选调控TNF诱导 necroptosis的重要基因，鉴定到NEK4的敲低可以显著抑制TNF诱导的坏死。进一步的研究发现抑制NEK4的表达阻断了TNF诱导的RIP1、RIP3的激活，提示NEK4可能通过调控坏死小体的形成而介导necroptosis。在此基础上，本项研究将利用已有的NEK4基因沉默细胞模型，并构建NEK4基因敲除动物模型，通过免疫沉淀、磷酸化检测、病毒感染后小鼠生存分析等手段深入研究NEK4调控necroptosis的具体分子机制，为阐明坏死相关疾病的分子机制提供新线索。

程序性坏死越来越多地被认识到，在诸多病理过程中是细胞死亡和诱发炎症的主要形式。细胞程序性坏死的紊乱会导致一系列人类疾病的发生。细胞程序性坏死在心肌梗死、动脉粥样硬化、局部缺血再灌注损伤以及免疫性疾病中具有重要的病理生理意义。因此，更深入的研究细胞程序性坏死的分子机制将对临床疾病治疗有重要价值。程序性坏死的特征是细胞膜破裂，释放诱发炎症的DAMPs，这也是其区别于凋亡的表型特征和生物学特性。随着研究的深入，人们发现程序性坏死是被信号通路精确调控的细胞死亡形式，而RIP1、RIP3和MLKL是程序性坏死通路的关键组分。但是，程序性坏死通路激活过程中，RIP1/RIP3坏死小体是如何形成的，MLKL下游分子是谁，依然不清楚，是亟待解决的该领域重要科学问题。本项目的前期研究工作通过大规模shRNA文库筛选，鉴定到NEK4特异地参与TNF诱导的程序性坏死信号通路调控。NEK4是2010年才被发现的蛋白质，目前已有的研究报导NEK4参与了稳定微管及纤毛生长的调控，其对坏死通路的调控未见报导。我们的研究发现，抑制NEK4的表达阻断了TNF诱导坏死过程中RIP3的激活，这一发现提示NEK4作用在RIP3上游，可能通过调控RIP1/RIP3坏死小体的形成而介导程序性坏死的发生。随后我们的实验证实了这一猜想，NEK4通过与RIP1的相互作用被招募到坏死小体复合物，而敲除NEK4抑制了RIP1/RIP3坏死小体的形成。我们利用HSV-1感染宿主细胞评价NEK4在病毒诱导的细胞程序性坏死过程中的作用，结果显示敲除NEK4能够抑制HSV-1诱导的细胞坏死。此前对程序性坏死调控机制的研究多集中与RIP3下游事件，坏死小体上游的分子事件还很不清楚。我们的研究结果第一次揭示了坏死小体形成的调控机制，将推动人们对坏死小体上游分子事件的认识。此外，NEK4作为近年来被发现的一个新基因，人们对其分子本质和生物学意义还了解甚少。我们的研究揭示了NEK4在抗病毒免疫过程中的作用，为深入认识NEK4的生物学功能奠定基础。同时，本研究也将为继续完善程序性坏死通路的调控方式和未来针对坏死相关疾病的治疗提供新的线索和科学依据。