抑制型量热式酶传感器检测农药过程中的酶热学问题及其微量热过程的调控

量热式酶传感器通用性强、不易受电化学活性物质或光学物质干扰，正逐渐成为快速检测食品中危害残留的新兴有效技术。但由于与危害残留相关的酶反应放热很小以及微热量快速测量困难等原因，该技术研究和实际应用受到限制。本项目基于前期研究结果，以农药残留检测为对象，拟借鉴免疫分析中采用酶标记等来放大初级免疫结合反应的方法，假设B-酯酶~农药抑制剂之间的专一性结合与免疫学中的抗体~抗原特异性结合非常相似，探索建立"竞争性抑制酶联反应分析法"，在较大范围内筛选反应热较大的标记酶及其相应的酶促热反应体系，有效放大酯酶~农药抑制结合反应和消除非特异性产热；并据此构建适用于抑制型量热式酶传感器反应热放大的一般规律，掌握影响量热式酶传感器实际量热精度的主要因素和控制方法，提出包括改进测热室结构、优化酶反应测热工作参数等在内的提高量热精度的措施。通过上述研究为量热式酶传感器的应用提供理论基础和实践指导。

量热式生物传感器具有通用性强和不易受电化学活性物质干扰等诸多优点，但因与食品危害残留相关的酶反应放热过小以及微热量难以快速测量等困难，严重制约了它在食品快速检测中的发展。因此，项目以农残检测为对象，从提高农药抑制响应、放大酯酶-农药反应以及探寻提高量热精度等入手，深入开展如下研究：.1）寻找到了有效提高酯酶对农药抑制响应的方法。发现采用分级盐析+透析，可使酯酶对农药的抑制响应提高14.30～26.26%，敏感酯酶回收率达67-74%；在优化的抑制条件（0.04mol/L、pH7.6PBS缓冲、36℃抑制13min）下，固定化酯酶对三唑磷和灭多威的抑制响应翻倍提高，但对另两种农药抑制响应变化不大甚至有所降低，其抑制过程中的传质阻力可能是其中的关键。.2）建立了有效放大酶-农药抑制反应的“竞争性酶联抑制法”。利用反应的光学和热学特性，建立了光度法与量热法同步联用测定酶促反应焓变的新方法，确定了过氧化氢酶和过硼酸钠作为标记酶和反应底物；优化碳二亚胺法制备酶标农药的条件为，pH6.0 MES缓冲、CAT与EDC、EDC与sulfo-NHS以及sulfo-NHS与MTD的摩尔比分别为1：30、3:1和1：2；以此构建的竞争性抑制酶联法可有效消除溶剂混合热，并使与农药残留相对应的放热量提高了1个数量级。.3）构建了以量热芯片为基础的FIA量热式生物传感器试验台。优化设计了NCM9924芯片、水气浴两重恒温以及可形成单独回路的圆环槽形作为试验台的量热芯片、恒温装置和测热室结构；采用增设缓冲装置的措施将0.8mV的量热噪声降为40 μV；于构建的试验台上进行了多次重复实验，其峰高相对标准偏差达4.27%。.4）探索了不同因素对酶催化反应热变化过程的综合影响规律。发现其中流量是决定测热效率的决定性因素，它不仅影响量热芯片的温度灵敏度还与酶促反应放热曲线的峰值到达时间、峰高以及峰积分紧密相关；在优化的流量0.4ml/min、底物120mmol/L条件下，0-60%范围的酯酶抑制率与标记酶酶促反应放热曲线积分呈良好线性关系，最大标准偏差为5%，同时还实现了0.5ppm-1 ppm毒死蜱和0.01-0.1ppm敌敌畏的定量检测，响应值均高于光度法。.以上研究发现为抑制型量热式酶生物传感器的反应热放大提供新思路，为量热式生物传感器优化设计提供指导。