利用转基因小鼠模型分析猪apolipoprotein R对脂肪沉积的影响

研究脂类代谢的分子调控机理具有重大意义。大量研究表明，载脂蛋白家族多个成员在脂类代谢中发挥重要作用，但未见R型载脂蛋白（apolipoprotein R, apoR)与脂代谢的相关研究。本课题组前期通过体外细胞转染实验，发现过表达猪apoR能够显著减少脂肪细胞内甘油三酯的积累，由此推断猪apoR具有减少动物脂肪沉积的作用。本研究拟建立脂肪组织特异表达猪apoR的转基因小鼠模型，通过分析转基因小鼠体重、体脂、血液生化、能量代谢、抗寒能力等指标，及脂肪组织形态学与脂代谢相关标志基因表达水平的变化，揭示猪apoR在动物体内对脂肪沉积的影响，并依此评估apoR在优质瘦肉型转基因猪新品种培育中的育种价值。本项目的意义在于首次在动物个体水平上揭示猪apoR对脂肪沉积的影响，为下一步通过转基因育种培育优质瘦肉型家猪新品种奠定基础；此外，还可以为研究apoR影响脂类代谢的分子机制提供动物模型。

随着我国转基因重大专项的开展，转基因（基因敲除）猪的技术越来越成熟，基因修饰猪群体数量也迅速增加。但大多研究项目集中在少数功能基因上，缺乏安全、高效、具有明确育种价值的功能基因，已成为限制整个产业发现的瓶颈。本课题组发现R型载脂蛋白（apoR）在盐酸克伦特罗减少猪脂肪沉积过程中发挥重要作用，本研究对通过转基因小鼠模型,评估apoR在转基因育种中的安全性和有效性。我们首先克隆得到猪Apolipoprotein R基因cDNA全长696bp，编码202个氨基酸，然后利用小鼠FABP4启动子驱动，通过显微注射构建脂肪组织特异性过表达apoR的转基因小鼠，获得三只阳性Founder小鼠（2只雄性，一只雌性），利用两只雄性小鼠扩繁至F3代总计获得99阳性小鼠。所有转基因阳性小鼠未见发育异常，并且能够稳定遗传外源基因。荧光定量PCR分析表明，apoR特异性表达于小鼠皮下脂肪和内脏脂肪中，骨髓中有微弱表达，其它组织未见表达。表明本项目成功构建了脂肪组织特异性转基因小鼠，外源基因apoR不仅可以稳定遗传，而且对转基因动物健康未见任何影响。接下来对转基因（TG）和野生型（WT）小鼠的脂肪沉积性状的差别进行研究，在低脂饲喂下（饲料10%脂肪，饲喂三个月），TG（n=10 ）与WT（n=10 ）小鼠在生长速度、体重和体脂组成方面，无显著差异；在高脂饲喂下（饲料45%脂肪，饲喂三个月），，TG小鼠平均体重32.27g ± 4.28（n=10），体脂含量17.04±2.7%，而野生型小鼠体重42.59g ± 3.78（n=10），体脂含量30.3 ± 3.6%，均显著高于TG小鼠。推断apoR可能具有抵抗饮食诱导型肥胖的作用。从TG和WT小鼠体内分离脂肪细胞原代培养物，其在激素诱导下分化能力无明显差别，但TG来源脂肪细胞积累甘油三酯能力显著弱于WT细胞（约相当于1/3），选择七条与脂类代谢密切相关的基因，通过real-time PCR分析其在两种来源的细胞中的表达丰度，均差异不显著，推断apoR在这些基因的下游。在CLB刺激下，TG来源脂肪细胞内甘油三酯积累量也无显著变化；而WT来源脂肪细胞内甘油三酯积累量显著降低，表明apoR可能是CLB减少甘油三酯积累过程中的限速酶。基于以上结果推断，apoR为CLB减少脂肪沉积过程中的关键分子，过表达apoR的转基因小鼠具有抗饮食诱导型肥胖的能力。