双功能酶-异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶(AceK)的结构功能及调节机制研究

As a key enzyme in the center metabolic regulation of E. coli, AceK is a rare bifunctional enzyme with protein kinase and phosphatase activities both remarkably shared at the same active site. The transformation mechanism of two activities in the same active center is unique and the understanding on it can expand our awareness of the enzyme and helps us design new engineered enzymes. AceK phosphorylates and dephosphorylates isocitrate dehydrogenase to control the partitioning of isocitrate between the Krebs cycle and the glyoxylate bypass, which plays an important role in microbial carbon metabolic regulation. The study on structure, function and multi-function features of AceK helps to understand the physiological mechanism of survival of E. coli and other bacteria in low nutrition. This topic mainly researches the catalytic mechanism of the bifunctional enzyme and the role of two unique loop loopβ3αC and SLR in AceK structure and function by accurately mutation design, combining with the physiological and biochemical methods on the basis of crystal structure; the selective activity and function of muations is futherly studied in vivo experiment; the interactions between small molecule metabolites and AceK and its mutants are studied using the latest MicroScale Thermophoresis technique. Further design, modification and application. These have a research and application of creativity.

大肠杆菌中心代谢调控关键酶AceK是罕见的在同一活性中心拥有激酶与磷酸酶活性的双功能酶。AceK的两种活性在同一活性中心的转换机制是独一无二的，对它的理解可以扩展我们对酶的认识，为设计新的工程酶提供思路。AceK通过对异柠檬酸脱氢酶磷酸化和脱磷酸化来调控异柠檬酸进入三羧酸循环或是进入乙醛酸旁路，在微生物的碳源代谢全局调控中起着关键作用。对AceK结构与功能及多功能特性的研究有助于了解大肠杆菌和其它细菌在低营养环境中的生存生理机制。本课题在晶体结构基础上，通过精确地突变设计，结合生理生化方法研究双功能酶的催化机制及两个独特的调节环loopβ3αC和SLR在AceK结构功能中的作用；同时体内实验验证突变体的选择性活性与功能；利用最新的微量热涌动技术研究小分子代谢物与AceK及其突变体的相互作用，进一步进行设计、改造和应用。具有鲜明的研究和应用创新性。

大肠杆菌中心代谢调控关键酶AceK是罕见的在同一活性中心拥有激酶与磷酸酶活性的双功能酶。AceK的两种活性在同一活性中心的转换机制是独一无二的，对它的理解可以扩展我们对酶的认识，为设计新的工程酶提供思路。对AceK多功能特性的研究有助于了解大肠杆菌和其它细菌在低营养环境中的生存生理机制。本项目充分利用生理生化实验、精确地突变设计、酶学实验、光谱学、微量热泳动、等温滴定量热技术、辅以计算机模拟等，完成了不同离子对AceK激酶磷酸酶活性、结构功能影响及相互作用研究来探索双功能酶的调节机制，了解了不同金属离子特别是锰离子对双功能酶AceK的调节机理；并结合已知的AceK结构，构建设计了loopβ3αC和SLR环的系列突变体，进行激酶活性与磷酸酶活性及其结构功能等特性的分析，了解了其独特的催化机制，鉴定出其产生作用的关键氨基酸，及这些重要氨基酸的改变对AceK结构和功能的影响，理解AceK作用机制与激酶磷酸酶活性反应机理。同时运用生化生理实验的方法结合微生物体内实验研究了AceK及其突变体的选择性活性与功能，探索了工程化AceK对细菌生理生态的影响，进一步了解了AceK在代谢途径中的调节作用，为激酶磷酸酶结构与功能及微生物生存机制的研究开发应用提供了理论基础。