酿酒酵母核糖核酸酶H及其介导的R环去除在减数分裂中的功能分析

Meiosis is essential for sexual reproduction. Meiosis maintains genetic stability and promotes genetic diversity. Thus it is a very hot research area in biology and is widely studied. However the mechanism(s) of meiosis is so complicated that is still not well understood. R-loop is a three-stranded nucleic acid structure, which is recently found, widely exists in organisms from prokaryotes to eukaryotes and involved in multiple biological processes, such as DNA replication and DNA damage response etc. Our unpublished results and other several studies indicate that R-loop also play important roles in meiosis. But how does R-loop regulate meiosis is unclear. R-loop is removed mainly by RNase H. In this project, we will study the roles of RNase H and its mediated R-loop removal in meiosis, to clarify which process(es) in meiosis is affected by R-loop accumulation and its molecular mechanisms. For this purpose, we will investigate the effect of the accumulation of R-loop on critical meiotic events involving pre-meiotic DNA replication, the formation and repair of DNA double-strand breaks, homologous chromosome pairing and synapsis, the level and distribution of crossover and non-crossover recombination, and chromosome segregation etc. we will apply multiple techniques in molecular biology, cellular biology, genetic biology and ChIP-seq to investigate the roles of R-loop in meiosis. The completion of this project will provide a new aspect for scientists to understand the mechanism(s) of meiosis.

减数分裂是真核生物有性生殖的必经环节，是维持物种遗传稳定性的基础，也是引起物种遗传多样性的前提。但是, 人们对于减数分裂的分子机制了解地还不够深入。R环（R-loop）是近年来发现的普遍存在于生物体内的一种三链核酸结构，参与了多种重要的生物学过程。最近发现R环也参与减数分裂。但是，它在减数分裂中的功能及其作用机制都不清楚。细胞内R环的去除主要由核糖核酸酶H介导。在本项目中我们将从遗传学、细胞学与分子生物学等多方面，综合运用多种技术手段，详细地解析核糖核酸酶H及其介导的R环去除在减数分裂，特别是同源重组中的作用。同时，利用免疫荧光和ChIP-seq分析R环的分布，以及与减数分裂DNA双链断裂和重组的分布之间的关系。这将有利于阐明R环在减数分裂中的功能及其作用机制，帮助人们从一个崭新的角度理解减数分裂的分子机制，最终为农作物的品种改良和人类生殖健康的改善奠定坚实的理论基础。

尽管人们对于减数分裂的基本过程已有所了解，但是很多关键事件的具体环节尚不清楚。R-loop是一种三链核酸结构，参与多种生物学过程，也与基因组的不稳定性相关。RNaseH可通过切割DNA-RNA杂合链中的RNA降解R-Loop。THO复合物等负责将转录的RNA及时运出细胞核以避免形成R-loop。近年发现，R-loop也参与减数分裂，然而，其在减数分裂中的功能并不清楚。为了深入系统的研究R-loop在减数分裂中的作用，我们以酿酒酵母为材料，一方面通过构建RNase H及THO复合物相关基因突变体（rnh1Δrnh201Δhpr1Δ），积累R-loop，分析R-loop与减数分裂重组事件的关系及R-loop累积对减数分裂的影响；另一方面，构建RNase H1诱导过表达突变体(pCUP1-rnh1)，大量去除R-loop，探究R-loop减少对减数分裂的影响。我们发现，R-loop大量累积导致减数分裂进程延迟，小孢子形成效率和存活率下降，核分裂异常比例增加。细胞学结果显示，R-loop与减数分裂重组蛋白RPA重叠；其数目随RPA数目的增加而增加。我们在R-loop累积突变体rnh1Δrnh201Δhpr1Δ中进一步引入spo11Y135F，结果减数分裂R-loop数目降低，核分裂延迟恢复至接近野生型水平，表明减数分裂中R-loop的产生及功能与重组相关。而且，减数分裂中R-loop的形成依赖于一定长度的DNA双链断裂3’末端，推测R-loop可能在重组修复中起作用。R-loop的一直积累导致交叉重组数目降低、减数核分裂延迟。进一步分析提示，R-loop积累可能降低了同源染色体之间的double-Holliday junction数量，从而降低交叉重组的数目，造成核分裂异常。此外，RNase H1过表达也导致减数分裂进程延迟，核分裂比例降低，孢子存活率下降。这些发现将有利于阐明R-loop在减数分裂中的功能及其作用机制，为深入理解减数分裂的分子机制奠定理论基础。