RPL32-2介导的基因转录调控及其在裂殖酵母营养生长细胞与沉默细胞相互转换中的作用

利用酵母研究细胞沉默作用是当前细胞生物学研究的一个前沿领域，对揭示生命的基本特征具有重要意义。我们前期研究发现粟酒裂殖酵母核糖体蛋白RPL32-2可诱导细胞沉默化作用，本课题采用所建立的过表达RPL32-2在含氮培养基中可模拟氮缺乏诱导裂殖酵母沉默细胞产生、敲除RPL32-2可抑制裂殖酵母在缺氮培养基中产生沉默细胞的模型，利用基因表达芯片技术研究营养生长细胞与沉默细胞转换过程中受RPL32-2表达水平影响的基因表达谱；利用ChIP-chip技术研究营养生长细胞与沉默细胞中RPL32-2的靶基因；利用免疫共沉淀技术-蛋白质质谱分析技术研究营养生长细胞与沉默细胞核中与RPL32-2相互作用的蛋白质；分析和验证最有可能与RPL32-2相互作用的蛋白、靶基因在体内、体外的相互作用，验证这种相互作用对受调控基因表达的影响，研究相关转录调控机制在细胞生长相与细胞沉默相及其相互转换中的生理作用及其意义。

研究发现, 裂殖酵母核糖体蛋白Rpl32-1和Rpl32-2在细胞沉默转化中具有不同功能。对数期时裂殖酵母细胞高表达Rpl32-2、低表达 Rpl32-1, 细胞进入平衡期时, Rpl32-1表达上升, Rpl32-2表达下调。过表达Rpl32-1抑制细胞生长，过表达Rpl32-2不抑制细胞生长；敲除rpl32-2比敲除rpl32-1更损害细胞生长，rpl32敲除受到损害的细胞生长能够被rpl32-2完全恢复，但只能被rpl32-1部分恢复; 过表达Rpl32-1抑制细胞分裂，产生4cDNA和多重细胞横隔，而过表达Rpl32-2促进细胞分裂。转录组学分析证明Rpl32 两个同源蛋白以不同方式调节与细胞分裂和胁迫反应有关基因，两者之间功能差异仅仅是95位氨基酸残基不同。裂殖酵母细胞可能通过调节RPL32两个同源蛋白间比例调节与细胞增殖和沉默相关基因表达，起到核糖体密码作用。研究还发现，敲除rpl32-1或rpl32-2可引发裂殖酵母无性絮凝作用, 敲除别的核糖体蛋白基因rpl21-2 和 rpl9-2 同样引发无性絮凝作用, 但敲除非核糖体蛋白基因 mpg 和 fbp不引起无性絮凝作用。与野生型WT菌株相比，敲除突变体rpl32-1Δ和 rpl32-2Δ细胞中RPL32总核糖体蛋白水平分别下降35.9% 和 46.9%, 总核糖体水平分别下降31.1% 和 27.8%。有趣的是，与非絮凝单倍体菌株YHL6381(h+)和 WT(h-)混合细胞相比，有性絮凝双倍体YHL6381/WT (h+/h-)细胞中核糖体蛋白表达水平和核糖体水平也大大地降低。转录组学分析表明，有性絮凝细胞中核糖体水平下降是由一系列核糖体合成相关基因表达受到阻遏作用所引起，而无性絮凝单倍体细胞中核糖体水平下降是由于核糖体蛋白基因敲除所引起。揭示敲除核糖体引发的单倍体无性絮凝作用实际上是模拟有性生殖过程中核糖体水平下降启动有性絮凝的过程。核糖体水平下降是细胞对环境营养成分缺乏的“紧缩反应”，通过将核糖体水平下降和絮凝作用偶联，细胞能够及时感应环境条件变化，启动有性生殖过程。研究结果不但证明RPL32蛋白在细胞增殖和沉默过程中的不同调节作用，而且还扩展到细胞有性生殖过程中的调节作用。上述结果分别在Eukaryotic Cell和PLOS One发表1篇论文，另有1篇论文FEMS Yeast审稿中。