肝细胞生长因子对急性心肌梗死再灌注治疗后心肌无复流的保护作用及机制研究

：无复流是急性心肌梗死再灌注治疗后的严重并发症，使住院死亡和再发心梗的机率增加4～10 倍,目前尚无有效防治措施。心肌缺血再灌注产生大量活性氧(ROS)损伤内皮细胞功能是无复流发生的重要原因。研究证实黄嘌呤氧化酶（XO）活性与组织再灌注后ROS的生成密切相关。我们前期研究发现低氧条件下内皮细胞XO活性增强,肝细胞生长因子（HGF）干预后，XO活性下降， ROS生成减少。本项目拟建立血管内皮细胞体外缺氧/复氧模型，探讨HGF在缺氧/复氧条件下通过抑制黄嘌呤氧化酶活性、减少ROS 生成从而保护内皮细胞功能的分子机制；构建中华小型猪缺血再灌注模型，在体研究HGF对心肌微循环的保护作用及对心肌组织XO基因表达和活性的影响，以期从分子水平、细胞水平和整体水平系统阐明HGF对再灌注后心肌微循环的保护作用及机制，为HGF在临床上用于防治急性心肌梗死再灌注治疗后心肌无复流提供理论基础和实验依据。

目的：建立血管内皮细胞体外缺氧/复氧模型，探讨HGF在缺氧/复氧条件下抑制黄嘌呤氧化酶活性、减少ROS生成,保护内皮细胞功能的分子机制。建立SD大鼠体内心肌缺血/再灌注模型，探讨HGF保护心肌缺血/再灌注损伤及相关机制。从分子、细胞和整体水平阐明HGF对再灌注后心肌微循环的保护作用及机制。.方法：原代培养大鼠心肌微血管内皮细胞，建立血管内皮细胞体外缺氧/复氧（H/R）模型。Annexin V-FITC&PI染色及caspase 3活性检测试剂盒检测细胞凋亡。DCFDA探针染色，流式细胞仪检测细胞内ROS含量。XO Activity Assay Kit检测细胞XO酶活力。Fulo-3/AM 染色检测细胞内Ca2+浓度。RT-PCR检测黄嘌呤脱氢酶（XDH）mRNA 的变化。XO及PI3K、P38MAPK、JAK2等蛋白量行western blot检测。冠状动脉结扎/松弛法建立SD大鼠在体心肌缺血/再灌注(I/R)模型，RM-6240型多道生理记录仪检测血流动力学指标，XO Activity Assay Kit检测血浆XO酶活力，Greiss法检测血清NO2-含量，TTC法检测心肌缺血范围。.结果：1.H/R诱导细胞凋亡率上升呈时间依赖性，细胞内ROS于H/R后上升。2.别嘌呤醇抑制H/R诱发的细胞凋亡和细胞内ROS升高，HGF抑制H/R后细胞凋亡和细胞内ROS升高。3.XDH mRNA、XO活性、XO蛋白量于H/R后显著升高。HGF抑制H/R诱发的XDH mRNA、XO活性、XO蛋白量上升。4.HGF抑制H/R后细胞内Ca2+浓度升高，细胞内Ca2+螯合剂、PI3K抑制剂和JAK2抑制剂抑制XO活性、XO蛋白量的升高。5.大鼠心脏I/R模型中，HGF改变再灌注损伤血流动力学和血液流变学特性,改善心肌组织再灌注损伤。.结论：H/R诱导微血管内皮细胞内XO蛋白表达与活化。XO在H/R条件下产生ROS，造成氧化应激并导致细胞凋亡。JAK2，PI3K信号通路在H/R条件下激活并经此促进XO蛋白表达及活化。H/R诱导细胞内游离Ca2+升高， HGF通过降低细胞内Ca2+浓度降低了XO蛋白表达及活化。体内I/R模型中，HGF降低XO活性，改变再灌注损伤心肌的血流动力学特性,改善心肌组织再灌注损伤，对急性心梗再灌注无复流的早期防治起到积极作用。.