联合过表达CXCR4基因的骨髓间充质干细胞和骨髓内皮前体细胞促进小体积移植肝再生及其机制的研究

Reduced-size liver transplantation (RSLT), including living donor LT and split LT has, in part, alleviated the shortage of donor organs. However, if GRWR less than 0.8% or GV/SLV less than 40%, small-for-size syndrome (SFSS) would occur, liver regeneration was blocked, eventually leading to loss of liver function and liver failure. Marrow-mesenchymal stem cells (MSCs) have the potential to inhibit the death of hepatocytes and stimulate liver regeneration following acute and chronic liver injury via a paracrine mechanism, or directly differentiate into hepatocytes and repopulate the injured liver. Our previous study have proved that CXCR4-transduced MSCs are more responsive to SDF-1α in vitro, and CXCR4 overexpression enhanced MSC engraftment into small-for-size liver graft and improved its effect on proliferation of hepatocytes by a paracrine mechanism, providing a significant one week's survival benefit. Coculture of Endothelial Progenitor Cells (EPCs) and MSCs demonstrate a synergistic effect on new vessel formation. Bone marrow-derived EPCs express highly HGF. In our application for tender, rats that underwent 30% RSLT were received cross-gender rat MSC or/and EPC transplantation. Using the green fluorescent protein and the specific Sry gene on Y chromosome, their distribution of homing and differentiation after infusion were detected. Expression of TNF-α, IL-1β, IL-6, HMGB-1, IL-4, IL-10, ET-1, eNOS, HO-1，AP-1,NF-κB，c-Myc，STAT3、p-STAT3，ERK1/2、p-ERK1/2，JNK、p-JNK，cyclin D1 and miscrovesseldensity in the grafts were detected. And we investigate whether CXCR4-MSC and bone marrow-derived EPC improve the small-for-size liver graft regeneration by paracrine mechanism, and whether VEGF, HGF is the key effector of MSC and EPC paracrine function, respectively. We also explore whether there is a synergistic effect combined transplantation of CXCR4-MSC and bone marrow-derived EPC.

供肝与受体间体积重量比过小将造成小体积综合征，引起移植肝再生障碍，甚至肝衰竭。骨髓间充质干细胞(MSC)能改善增生环境，促进肝再生。我们的前期研究发现过表达CXCR4的MSC（CXCR4-MSC）显著促进小体积移植肝再生。体外研究证实内皮前体细胞（EPC）与MSC分泌的因子在血管发生上存在互补效应。本申请拟建立30%大鼠肝移植模型，以性别交叉移植方式将骨髓来源的CXCR4-MSC、EPC输入动物体内，利用Y染色体特异Sry基因及病毒所携带的绿色荧光蛋白报告基因，观察它们在移植肝内分布、归巢和分化；检测炎症因子、肝再生信号通路蛋白等的表达及微血管的生成，探讨CXCR4-MSC和EPC通过旁分泌功能改善小体积移植肝再生微环境、调控肝再生的分子机制并寻找关键性效应因子。观察CXCR4-MSC和EPC是否具有协同效应，为联合应用CXCR4-MSC和骨髓来源的EPC促进小体积移植肝再生提供理论依据。

我们既往研究也表明，过表达CXCR4的MSC通过外周循环途径输注后迁移入肝的细胞数明显增加，肝细胞增殖显著，移植动物一周生存率得以提高。本研究中我们发现联合CXCR4-MSC和EPC治疗组中30%肝移植大鼠一周生存率（12/15）高于CXCR4-MSC治疗组（10/15）及EPC治疗组（4/15）；.前期研究发现CXCR4-MSC在早期主要通过旁分泌途径改善移植肝组织再生微环境而促进小体积肝移植物再生，CXCR4-MSC中VEGF表达量高。在实验组（30%PLT+CXCR4-MSC; 30%PLT+CXCR4-MSC+VEGF中和抗体组），VEGF中和抗体不影响CXCR4-MSC迁移入肝，通过检测不同时间点肝细胞、肝窦内皮细胞凋亡和IL-6、TNF-α、HMGB-1、IL-4、IL-10等相关炎症细胞因子基因及蛋白水平的表达情况及肝细胞、肝窦内皮细胞增殖和移植术后72h移植肝内相关信号途径蛋白表达情况，发现VEGF中和抗体不影响CXCR4-MSC减轻肝损伤的效应，但其明显减弱CXCR4-MSC对早期肝再生（72h）的促进效应，与细胞增值相关的蛋白p-STAT3、p-ERK1/2、cyclinD1表达下降（P˂0.05）。上述结果一方面说明VEGF对早期肝脏再生具有较重要的作用，另一方面提示VEGF是CXCR4-MSC促进肝早期再生的重要效用因子，研究结果显示，其不影响CXCR4-MSC的晚期（168h）促肝细胞增值效应。.在实验组（30%PLT+EPC；30%PLT+ EPC +HGF中和抗体组）中，HGF中和抗体不影响EPC的迁移，通过检测不同时间点肝细胞、肝窦内皮细胞凋亡和IL-6、TNF-α、HMGB-1、IL-4、IL-10等相关炎症细胞因子基因和蛋白表达情况及肝细胞、肝窦内皮细胞增殖和移植术后72h移植肝内相关信号途径蛋白表达情况，我们发现HGF中和抗体不影响早期肝细胞和肝窦内皮细胞损伤，不影响早期肝窦内皮细胞再生（72h，P˃0.05），不影响其分化为肝窦内皮细胞（72h，P˃0.05），在早期即可发现少量EPC分化为肝窦内皮细胞，但影响肝实质细胞再生（72h，P˂0.05）。因此，EPC可以通过直接分化为肝窦内皮细胞及分泌HGF的旁分泌机制参与和促进肝再生；HGF可能是EPC促进肝脏再生的重要效应因子。我们认为，联合应用CXCR4-MSC和骨髓来源的E