蛋白激酶在小鼠受精卵早期发育中的调控

We have identified Cdc25B phosphorylation sites by PKA in vitro including S321、S229 and S149.On this basis,we want to verify PKA also can regulate the early development of fertilized mouse eggs by phosphorylating S15 of Wee1B. Meanwhile,PKC can phosphorylate S96 of Cdc25B,afterwards activate MPF and promote embryos development.PIPP inhibits the activity of Akt which phosphorylates S351 of Cdc25B,then boost the development of fertilized eggs.Reversely,AC inhibits the activity of MPF and development of zygotes by cAMP production and PKA inhibition.So we found two control signal pathways,one of which is negative and another is positive in the early development of fertilized mouse eggs (even in process of the development of mammals fertilized eggs).This study has important theoretical value in the revealing of mammals molecular mechanism of the development of fertilized eggs.

在已发现小鼠受精卵早期发育的调控中PKA可通过对CDC25B的321、229、149位磷酸化的基础上，进一步研究PKA可通过对WeelB的15位的磷酸化抑制MPF的激活进而抑制受精卵的发育。PKC则是通过对CDC25B的96位磷酸化激活MPF促进受精卵的发育。PIPP通过抑制Akt的活性，Akt则是通过对CDC25BS 351位磷酸化激活MPF促进受精卵的发育。AC是通过促进cAMP的生成激活PKA的活性，抑制MPF的活性，从而抑制受精卵的发育。这样我们在小鼠受精卵的早期发育（乃至哺乳动物受精卵的发育过程中）发现一正一负的两种调控信号通路。该研究对揭示哺乳动物受精卵发育的分子机理有极其重要的理论价值。

在小鼠受精卵中，蛋白激酶可能通过调控肌动蛋白细胞骨架适当的组装和分布调控早期胚胎发育。然而，在哺乳动物中，特别是小鼠受精卵中，调节肌动蛋白细胞骨架的机制和参与因素所知甚少。本研究旨在通过调节肌动蛋白细胞骨架的分布，确定mTORC2、PKB/Akt、Girdin、Greatwall激酶、p-CDC25B-Ser351 and p-Cyclin B1-Ser123在小鼠受精卵早期发育中的作用。用mTORC2 shRNA，Akt siRNA或Girdin siRNA处理后，F-actin的改变可以通过免疫荧光染色和激光共聚焦显微镜观察。Se1417位点的磷酸化水平用Western　immunoblotting检测。细胞分裂的百分数用体式显微镜计数检测。我们的结果显示，RNAi介导的mTORC2，Akt1或Girdin中断了F-actin的重排，并且明显的抑制了小鼠受精卵的发育。 PKB/Akt已经被证明是mTORC2信号途径的一个下游靶点。Girdin，新发现的肌动蛋交叉连接子，已经被证明是Akt信号途径的一个下游靶点。而且，mTORC2的敲除影响了Akt1和Girdin的磷酸化。Akt1通过Girdin介导的F-actin重排正性调节小鼠受精卵的发育。Girdin能够是Akt1介导的信号途径的一个下游靶点。总之，我们证明了mTORC2/Akt在F-actin组装中通过调节Girdin，参与小鼠受精卵早期胚胎的卵裂。同时也发现14-3-3ε结合PKA磷酸化的CDC25B-S321诱导了1-细胞阶段有丝分裂的停滞。我们也在小鼠卵母细胞中我们不但检测到了Greatwall激酶具有释放小鼠卵母细胞双线期停滞的作用，也检测到p-CDC25B-Ser351和p-Cyclin B1-Ser123向中心体连续的聚集促成了小鼠卵母细胞前I期阻滞的释放。