表达外源性细胞骨架蛋白或结构蛋白抑制细胞凋亡的机制探讨

本课题组在研究微管相关蛋白tau与细胞生存之间关系的过程中发现，除结构蛋白tau外，分别转染细胞骨架蛋白中的肌动蛋白β-actin、中间纤维丝vimentin、亨廷顿蛋白相关蛋白1（HAP1A和HAP1B）以及神经元内特有的结构蛋白-中分子量的神经细丝（NFM）的质粒均有抗凋亡作用。这些蛋白的共性是：氨基酸数目差别不大；主要分布于胞浆，除NFM外其余的均在核内有分布；富含丝/苏氨酸位点，容易被某些相同的蛋白激酶磷酸化。我们前期证实tau抗凋亡作用与wnt/β-catenin信号通路有关。为了探讨上述骨架蛋白和结构蛋白的抗凋亡作用和机理，本项目拟在细胞株水平，转染不同的质粒，研究上述蛋白①对抗细胞凋亡的作用；②细胞内的定位和表达水平、磷酸化状态的变化与抗凋亡作用之间的关系以及③抗凋亡作用是否都与wnt/β-catenin信号通路有关，研究结果将对认识神经退行性疾病的发生发展和机理有重要意义。

微管相关蛋白tau、神经原纤维蛋白NF、角蛋白丝Vimentin、微丝actin都是细胞内重要的骨架或者结构蛋白，本室前期结果证实这些蛋白对细胞均有不同程度的抗凋亡作用，但具体机制不明。本项目研究发现，tau抗凋亡作用最强，NF最弱。tau与多种神经退行性疾病如老年痴呆（AD）、肌萎缩侧索硬化（ALS）关系密切，故以tau作为研究重点。结果：⑴分析对鼠成神经瘤细胞株（N2a）进行凋亡诱导前后tau在细胞内的分布，我们发现凋亡诱导致更多的tau进入到胞核；我们构建了带核定位序列（NLS）的中分子量NF（NFM）质粒，转染N2a，凋亡诱导致原本抗凋亡作用弱的NFM发生核转位，且有很强的抗凋亡作用，说明核转位与抗凋亡密切相关。⑵通过分析tau的氨基酸序列，我们找到了其疑似核定位序列，将tau全长质粒分成两个片段，前段（tau1-220）包含疑似定位序列，后段（tau221-441）不包含此序列，构建质粒，结果证实与转染tau221-441相比，转染tau1-220的细胞在凋亡诱导时更多的tau从胞浆转位胞核，且与DNA小沟结合，稳定其结构。电镜结果亦显示tau定位于成年鼠皮质神经元和转染tau441的N2a细胞（N2a/tau441）的胞核及核膜上。⑶ tau核转位抑制凋亡是否与其磷酸化水平相关？去血清饥饿处理（促凋亡）N2a/tau441细胞，发现，胞浆内ser404位点磷酸化tau增加，而胞核内ser404位点磷酸化tau下降，且与此位点磷酸化密切相关的糖原合酶激酶3β（GSK-3β）的活性在胞浆内升高而在胞核内下降。PI3K/Akt信号通路为调节GSK-3β活性的重要上游因子，因此进一步检测胞浆和胞核内总Akt和活化的Akt的表达，结果显示总Akt表达无变化，但更多活化的Akt进入核内。文献报道tau可与Akt上游PI3K的调节亚基p85α结合，解除p85α对PI3K的催化亚基p110的抑制，使p110更多的募集到胞膜上，激活胞内Akt，活化的Akt进入到核内，导致核内GSK-3β活性下降，非磷酸化tau增多，结合DNA小沟，使细胞在短期内逃逸凋亡，但由于胞浆内tau的含量逐渐下降和磷酸化状态tau的升高，最终导致进入核内的tau减少，细胞发生缓慢的退行性变化，难逃死亡命运。本研究较系统的探讨了tau对细胞的保护机制，可能为以后延缓此类疾病发病进展找到一个靶点。