香蕉束顶病毒B4蛋白抑制RNA沉默信号共质体转运的分子机制解析

Banana bunchy top virus (BBTV) is causal agent of banana bunchy top disease, widely distributing in banana producing areas around the world and seriously threatening the productivity of banana planting. BBTV is not only a virus infecting important economic crop, but a typical representative of the plant DNA viruses. In this study, on the basis of which N-terminal transmembrane region of B4 encoded by BBTV DNA4 component has positive relationship to inhibition of plant RNA silencing and the conserved B4 interactional factor (B4IF) was baited via coimmunoprecipitation technique, we will further perform subcellular colocation and GST pull-down experiments to confirm the in vivo and in vitro interaction, respectively. Then, the B4IF orthologue gene in Arabdopsis will be generated TALEN-mediated specific, the b4if mutant over expressing GFP will be grafted with the trangenic Arabidopsis producig GFP siRNAs combinding with sRNAs deep sequencing, these results will contribute to analysis the symplastic transportation pathway of silencing signal involved by B4IF. Similarly, through the graft and siRNAs deep sequencing tests, the affirmatory operational manner of inbition of RNA silencing by B4 will be elucidated. Finally, the functionary mechanism of B4 and B4IF afftecting RNA silencing movment will be synthetically clarified，and the related model will also be addressed. These findings also provide some valuable general informations for the symplastic transportation of RNA silencing signal.

香蕉束顶病毒（BBTV）是香蕉束顶病的病原，在国内外香蕉产区分布广、危害重。BBTV既是危害经济作物的病毒，也是植物DNA病毒的典型代表之一。本研究在明确BBTV 的B4蛋白 N端跨膜区与抑制植物RNA沉默的呈正相关性以及借助免疫共沉淀技术调取与B4互作的保守蛋白因子(B4IF)的基础上,进一步通过亚细胞共定位和GST pull-down进行体内外互作验证，并由TALEN技术介导拟南芥B4IF直系同源基因的靶向突变，过表达GFP的B4IF突变株与产生GFP siRNAs拟南芥进行嫁接，通过GFP荧光指示沉默信号的运动和siRNA深度测序，以解释B4IF对siRNA转运的影响；类似地，通过嫁接和siRNA深度测序以阐明B4抑制RNA沉默的具体作用方式。最后，综合阐析B4和B4IF对RNA沉默运动的影响，并提出相关模型。研究结果也将为解析沉默信号的共质体转运提供一些普适性的信息。

香蕉(Musa spp.)现是世界第一大宗热带水果，也是世界第四大粮食作物，世界香蕉的一半产量来自单基因型三倍体（AAA）卡文迪许尖叶蕉（Musa acuminata）。尖叶蕉可被多种病害感染，其中包括香蕉束顶病毒（Banana bunchy top virus, BBTV）引起的束顶病以及尖孢镰刀菌（Fusarium oxysproum）引起的枯萎病长期危害香蕉生产。BBTV是蚜传病原病毒，是严格的寄生物；尖孢镰刀菌是半腐生真菌，并且维管束组织是其两者主要的侵染部位，则这两种病原存在微生态位的竞争拮抗关系。本项目在进行BBTV致病决定因子B4蛋白研究的过程中，并分析了B4蛋白对镰刀菌的拮抗性。在此，展开以下几方面研究：（1）B4蛋白在模式植物中的亚细胞定位分析；（2）验证B4蛋白的寄主互作因子；（3）B4蛋白体内外拮抗镰刀菌的研究。. 经过研究表明B4蛋白主要定位于维管束细胞的外膜以及胞质细胞骨架和叶绿体的内膜上;并通过免疫共沉淀钓取与B4蛋白共定位的寄主蛋白酶，为B4蛋白的功能性分析奠定良好基础；再者，纯化的B4蛋白能够抑制尖孢镰刀菌分生孢子的萌发和菌丝生长，并且B4GFP转基因番茄在整个生育期对镰刀菌具持久抗性。.B4蛋白含有单次跨膜基序，具备独特的结构域，既抑制基因沉默，也兼负着病毒的系统转运和胞间运动。这暗示与众不同的抑制基因沉默的作用方式，也为阐明BBTV共质体转运的机制提供一个很好切入点。B4蛋白与寄主蛋白酶因子的共定位互作，暗示着B4蛋白是一前体，在蛋白酶的作用下变为功能肽。另外，B4蛋白是天然的镰刀菌候选抗性基因，这展现出重要的理论及其应用价值。