MicroRNA-31影响儿童肝移植术后免疫抑制剂疗效的分子遗传机制研究

The pharmacokinetic variability affects the therapeutic effect of immunosuppressant after pediatric liver transplantation，which is the primary cause for the graft rejection and infection. Although genetics and epigenetics play an important role in the process, the mechanism remains to be investigated. Our previous study identified that there was a difference of miR-31 expression in pediatric individuals according to their metabolic rate, indicating that miR-31 involves in the process of drug metabolism. We proposed that both the differential expression and diverse function of miR-31 contribute to the different effect of immunosuppressant. This project will verify the following hypothesis by means of knockout mouse, bioinformatics and molecular genetics: 1) the polymorphism of miR-31 genes and copy number variations (CNVs) of miR-31 contribute to the diversity of miR-31 expression between extensive metabolizers and poor metabolizer; 2) The low expression of miR-31 results in the accumulation of multiple drug metabolize genes, which affects the rate of drug metabolism; 3) The genetic polymorphisms of target genes affect the regulation of miR-31 and therefore involves in drug metabolism process. The expected results of this project will contribute to establish a personalized immunosuppressant dosage regimen, reduce the occurrence of infection and immune rejection and thus improve survival rate as well as health related quality of life for pediatric liver transplant patients.

药物代谢速率影响了儿童肝移植术后免疫抑制剂的疗效，是造成术后免疫排斥和感染的主要原因。遗传和表观遗传调节在其中起着重要作用，具体机制有待进一步研究。我们前期研究发现在快代谢和慢代谢组之间具有显著差异的miR-31参与了药物代谢过程。我们认为miR-31表达和功能的异常影响儿童肝移植术后免疫抑制剂疗效。本项目将通过基因敲除小鼠、生物信息学以及分子遗传学手段，验证以下假说：1）miR-31基因变异（SNP和CNV）是造成免疫抑制药物快、慢代谢组之间miR-31表达差异的原因之一；2）快代谢组个体肝组织中miR-31低表达，导致多个药物代谢基因的累积，从而影响了药物代谢速率；3）靶基因的遗传多态性影响miR-31对靶基因的调节从而参与药物代谢过程。本项目的预期结果将有助于更好的为小儿肝移植术后免疫抑制剂的服用提供个体化指导，减少感染和免疫排斥的发生，提高小儿肝移植术后生存率和生活质量。

项目的背景：他克莫司已成为防治器官移植术后排斥反应的最重要的免疫抑制剂，然而其药动学个体差异大及治疗窗窄，尤其是对于小儿肝移植患者，其药动学差异可达到十倍，已有研究发现CYP3A5基因多态性与药动学密切相关，然而是否存在一些表观遗传因素（如miRNAs）影响他克莫司的代谢。.主要研究内容：采用多中心随访观察性研究，纳入2017年12月-2018年6月234例儿童肝移植患者，收集患者术前临床资料，并记录术后他克莫司剂量及血药浓度；收集其中26例基因型为*1*3的减体积供肝标本，采用PCR-base单核苷酸测序法确定CYP3A5基因型，qRT-PCR测定供肝组织中miRNA及相应靶基因的表达水平。体外实验建立人鼠保守的miRNA过表达文库，在HepaRG细胞和HepLPCs中采用他克莫司代谢的高通量筛选；采用ELISA、qRT-PCR、双荧光素酶实验、Western-blot等方法检测miRNAs及相应靶基因对他克莫司代谢的作用。.重要结果：供体CYP3A5基因型是术后他克莫司代谢的重要独立因素，且对其代谢贡献为16.9%。高通量筛选发现miR-29a-3p，miR-99a-5p，miR-532-5p 和 miR-26-5p既参与他克莫司代谢，且在正常肝脏中高表达。通过敲除CYP3A5基因后转染miRNAs，他克莫司代谢与对照组无明显差异。转染miRNAs后HepaRG细胞和HepLPCs中CYP3A5基因和蛋白表达水平降低。通过TargetScan靶点预测、双荧光素酶及功能学实验，证实miR-29a-3p，miR-99a-5p和miR-532-5p通过抑制HNF4α，NR1I3和NR1I2间接的影响CYP3A5的表达，而miR-26-5p直接靶向抑制CYP3A5表达，最终影响他克莫司的代谢。且供肝组织中miRNAs与术后他克莫司C/D值成正相关，与相应的靶基因的表达成负相关。.关键数据：供体基因对他克莫司的影响占主导作用。相同基因型患儿供肝CYP3A5基础表达水平同样是他克莫司代谢的重要因素，miR-29a-3p，miR-99a-5p，miR-532-5p和miR-26-5p间接或直接靶向抑制CYP3A5表达，最终影响他克莫司代谢。.科学意义：本项目的结果将有助于更好理解miRNAs参与他克莫司代谢，为miRNAs靶向供体移植物调节他克莫司代谢成为一种新的治疗策略。